饲料中类胡萝卜素在大黄鱼皮肤中的沉积及其分离鉴定

2019-01-02申豪豪易新文张文兵麦康森

饲料工业 2018年10期

■申豪豪牟华李俊易新文张文兵麦康森

（水产动物营养与饲料农业部重点实验室海水养殖教育部重点实验室中国海洋大学水产学院，山东青岛266003）

体色不仅是养殖鱼类品质的一个重要指标，同时也反映了鱼类的健康状况，影响鱼类的商品价值和市场认可度。大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国重要的海水养殖鱼类，2016年我国人工养殖大黄鱼产量已达16.54万吨，居海水养殖鱼类第一。野生大黄鱼皮肤金黄，唇部为红色，深受消费者的喜爱。然而，高密度养殖大黄鱼的体色严重退化，降低了消费者的认可度，其市场售价与野生大黄鱼相差几十倍甚至上百倍。

影响鱼类体色的因素有很多，如光照、温度、背景色及营养物质等，其中类胡萝卜素是影响鱼类体色的主要因素之一[1-4]。鱼类像其它脊椎动物一样，不能从头合成类胡萝卜素，必需从食物中摄取[5]。目前，在鱼类体内发现多种类胡萝卜素，如虾青素、黄体素、玉米黄质、金枪鱼黄素等[6-7]。饲料中添加适宜的类胡萝卜素，对于改善鱼类体色有着重要作用。不同鱼类体内的类胡萝卜素组成存在差异，因而饲料中添加的有效呈色作用的类胡萝卜素有所不同。研究发现虾青素是鲑鳟鱼体内的主要色素，如大马哈鱼（Salmosalar）[8]、细鳞大麻哈鱼（Oncorhynchusgorbuscha）[9]和大西洋鲑（Salmo salar）[10]等。因此，虾青素和各种虾青素源被广泛用于提升鲑鳟鱼肌肉的红色值[11-14]。

鱼类类胡萝卜素组成不同，这可能是由于类胡萝卜素代谢差异所造成的。Schiedt等[15]报道在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）中部分虾青素双酯被代谢为玉米黄质。Schiedt[16]发现鲤科鱼类能够通过氧化修饰作用将玉米黄质转化为虾青素。Tsushima等[17]发现在日本方头鱼（Branchiostegus japonicas）中，虾青素被代谢为金枪鱼黄素。Gomes等[18]也报道发现在金头鲷（Sparusaurata）中，虾青素被代谢为黄体素酯和表黄体素酯。Yi等[19-20]研究了饲料中添加不同类胡萝卜素（虾青素、黄体素、角黄素）对大黄鱼体色的影响，结果发现，这些类胡萝卜素的使用都可改善大黄鱼的体色，然而效果存在差异，其中黄体素具有更好的着色效果，说明黄体素可能是大黄鱼皮肤中的主要色素。但有关大黄鱼皮肤中类胡萝卜素的组成及代谢情况却仍然不清楚。

本研究选择虾青素和黄体素为实验类胡萝卜素添加到配合饲料，对大黄鱼进行养殖实验，研究其对大黄鱼皮肤呈色的影响，并对皮肤中的类胡萝卜素各组分进行分离和鉴定，为通过饲料营养途径改善养殖大黄鱼的体色提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

甲醇和甲基叔丁基醚（MTBE）为色谱纯，正己烷、丙酮、乙醚、氢氧化钾和二叔丁基对甲酚（BHT）均为国产分析纯，水为超纯水。

安捷伦1100高效液相色谱仪(配备G1313A二元泵，G1313A高效自动进样器，G1316A柱温箱，G1315ADAD检测器)，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 养殖实验

以无类胡萝卜素添加的饲料为对照组（CD组），在此基础上分别添加80 mg/kg的虾青素（帝斯曼，荷兰）和黄体素（广州智特奇生物科技有限公司，中国），分别命名为AST80和X80饲料组。饲料配方及营养水平见表1。

表1 饲料配方及营养水平（干重）

养殖实验用大黄鱼购自宁德市富发水产有限公司，于4.0 m×4.0 m×4.0 m的海水网箱中暂养2周，暂养期投喂对照组饲料。养殖实验开始前，所有大黄鱼饥饿24 h，使用1∶10 000稀释的丁香酚麻醉。选取规格一致的大黄鱼，称重并随机分配到9个2.0 m×2.0 m×2.5 m的网箱中，每个网箱放养50尾。养殖实验期间，每天饱食投喂两次（6:00和18:00），养殖周期9周，水温18～28 ℃，盐度28～32 g/l，溶氧6.2～8.3 mg/l。

1.3 样品采集与体色测定

养殖实验结束时，所有大黄鱼饥饿24 h，并用1∶10 000稀释的丁香酚麻醉，然后取样。每个网箱中随机抽10尾鱼取皮肤，皮肤样品用铝箔包裹保存于-80℃冰箱中。

大黄鱼体色按照国际发光照明委员会CIE（CIE,1976）的规定测定，L*代表亮度值、a*代表红色值、b*代表黄色值。使用CR-400型色彩色差计（柯尼卡-美能达，日本）于夜间20:00至24:00进行测定，避免外源性光照对大黄鱼体色的影响。每个网箱随机取5尾鱼，在背部和腹部皮肤分别选取2个点测定体色值，尽量保证检测部位的一致性。

1.4 大黄鱼皮肤中类胡萝卜素的分析

大黄鱼皮肤中类胡萝卜素的分析参考相关方法并进行改良[18，21-24]。准确称取0.25 g大黄鱼皮肤于离心管中，加入10 ml丙酮，使用匀浆机匀浆1 min。将离心管在4℃、5 000×g转速的离心机中离心5 min，吸取上层提取液，再加入丙酮，反复萃取直到无色。合并萃取液，加入4 ml甲醇-正己烷（1∶1，v/v）混合提取液和2 ml超纯水，震荡离心管，静置分层后吸取上层正己烷层。在正己烷层萃取液加入4 ml 30%KOH-甲醇（w/v）溶液，充入氮气，于40℃避光皂化反应1 h。皂化结束后加入4 ml 3%NaCl（w/v）溶液，将离心管在4℃、转速为5 000×g的离心机中离心5 min，吸取上层正己烷层萃取液，用超纯水清洗，直到清洗液为中性；在剩余提取液中加入4 ml乙醚，将离心管在4℃、5 000×g转速的离心机中离心5 min，吸取上层乙醚提取液，用超纯水清洗，直到清洗液为中性；合并正己烷和乙醚萃取液，氮气吹干，溶于1 ml甲醇（0.05%BHT）中，然后进行HPLC分析。

1.5 统计分析

所有数据采用SPSS19.0软件进行单因素ANOVA分析，每个处理3个重复，结果以“平均值±标准误”来表示。当P＜0.05时，认为有显著性差异，并进行Tukey's多重比较。

2 结果

饲料中虾青素和黄体素对大黄鱼皮肤呈色的影响结果见表2。各处理组在背部皮肤亮度值、腹部皮肤亮度值和背部皮肤红色值上没有显著性差异（P＞0.05）。在腹部皮肤红色值方面，类胡萝卜素添加组高于对照组，最高值出现在虾青素组，然而无显著性差异（P＞0.05）。在背部皮肤黄色值方面，黄体素组显著高于对照组和虾青素组（P＜0.05），虾青素组和对照组间无显著性差异（P＞0.05）。在腹部皮肤黄色值方面，黄体素组和虾青素组显著高于对照组（P＜0.05），然而黄体素组和虾青素组间无显著性差异（P＞0.05）。

表2 饲料中虾青素和黄体素对大黄鱼体色的影响

饲料中虾青素和黄体素对大黄鱼皮肤类胡萝卜素含量和各组分比例的影响结果见表3。类胡萝卜素添加组大黄鱼皮肤中类胡萝卜素的总含量显著高于对照组（P＜0.05），黄体素添加组显著高于虾青素添加组（P＜0.05）。在所有处理组中，黄体素占大黄鱼皮肤中类胡萝卜素比例最高，在53.04%～67.55%之间，金枪鱼黄素次之（30.87%～43.76%）；全反式玉米黄质所占比例最低（1.01%～3.20%）。

饲料中虾青素和黄体素对大黄鱼皮肤类胡萝卜素组分的影响见图1。对照组和色素添加组间类胡萝卜素组分无差异，共有7种类胡萝卜素被检测到。虽然AST80组添加了虾青素，然而却在所有处理组的大黄鱼皮肤中均没有检测到虾青素。

3 讨论

图1 不同处理组大黄鱼皮肤中类胡萝卜素组分的液相色谱图

在本研究中，各处理组大黄鱼在背部皮肤亮度值和腹部皮肤亮度值上没有显著性差异。Kalinowski等[25]报道真鲷皮肤亮度值不受饲料中类胡萝卜素含量的影响。Yi等[19-20]在大黄鱼中也有类似发现。通常情况下，虾青素被认为是红色色素用于鱼类的色素沉积。Chatzifotis等[26]发现虾青素能够提高真鲷皮肤的红色值，相似的结果在牙鲆（Paralichthysolivaceus）[27]和玫瑰鲫(Pethiaconchonius)[28]中也被发现。然而，在本研究中，各处理组大黄鱼背部皮肤红色值和腹部皮肤红色值没有显著性差异，可能的原因是虾青素被转化为其它的色素。黄体素是黄色的色素，被广泛用于提高鱼类皮肤的黄色值。在本研究中，黄体素组大黄鱼背部皮肤黄色值显著高于对照组和虾青素组。在腹部皮肤黄色值方面，黄体素组和虾青素组显著高于对照组。Chatzifotis等[26]报道黄色的类胡萝卜素（黄体素和玉米黄质）能够显著的提高真鲷的黄色值。本研究显示黄体素是大黄鱼皮肤中的主要色素（见表3），然而，在腹部黄色值方面，虾青素组和黄体素组间没有显著的差异，这表明在腹部黄色值方面可能存在一个饱和度。

在本研究中，黄体素组大黄鱼皮肤中的类胡萝卜素含量比对照组和虾青素组高，这表明与虾青素相比，大黄鱼能够更好的利用黄体素，这个结果与Yi等[19]的研究结果一致。Li等[29]也发现斑点叉尾鮰（IetalurusPunetaus）皮肤中主要沉积黄体素和玉米黄质而不是虾青素和角黄素。然而，相关研究发现，与角黄素相比，大西洋鲑能够更好的利用虾青素，相似的研究结果在银大马哈鱼(Oncorhynchuskisutch)上也被发现[30]。可能的原因是鱼类对类胡萝卜素的利用上具有物种差异性。虾青素是鲑鱼的主要色素，然而，本研究表明黄体素是大黄鱼皮肤中的主要色素，大黄鱼更倾向于沉积黄体素在皮肤中。

在本研究中，各个处理组的大黄鱼皮肤中类胡萝卜素的组分没有差异，且均没有检测到虾青素，包括虾青素饲料添加组，这显示大黄鱼不沉积虾青素，并可能将吸收的虾青素转化为其它类胡萝卜素。鱼类含有各种各样的类胡萝卜素[6，15，31]，并能通过对双键的氧化、还原及裂解作用等修饰它们[7]。Tsushima等[17]报道日本方头鱼通过还原作用将虾青素经4-酮基玉米黄质、玉米黄质、4-酮基黄体素和黄体素转化为金枪鱼黄素。Gomes等[21]发现在金头鲷中，虾青素被代谢为黄体素酯和表黄体素酯。同样地，Maoka[7]也报道了鲈形目鱼类可以将虾青素经金盏花黄素、玉米黄质和ε-ε-胡萝卜素-3,3'-二酮最终转化为金枪鱼黄素。虾青素是鲑鱼中的主要色素，然而，Matsuno[6]报道鲑鱼不能通过代谢修饰作用从其它类胡萝卜素合成虾青素。与此相反，Schiedt[16]发现鲤科鱼类能够通过氧化修饰作用将玉米黄质转化为虾青素。这显示鱼类在类胡萝卜素代谢上存在差异，可能是由于物种不同导致。在本研究中，黄体素占大黄鱼皮肤中类胡萝卜素的比例最高（53.04%～67.55%），其次是金枪鱼黄素（30.87%～43.76%），玉米黄质含量最低（1.01%～3.20%）（见表3）。Yi等[19]发现大黄鱼皮肤的黄色值随着饲料中黄体素/虾青素比值的降低而降低，推断大黄鱼能够在一定程度上将虾青素转化为黄色的色素。综合本研究和已发表的相关数据，可以推测在大黄鱼中虾青素可能经黄体素和玉米黄质最终被转化为金枪鱼黄素。然而，本研究的结果只是来自大黄鱼的皮肤，还缺乏肌肉或其他组织色素沉积的数据，有关上述推测还需要进一步的研究。