响应面法优化肉鸭日粮非淀粉多糖酶酶谱的研究

2019-01-02单春乔陈桂芳冯柳柳江国托

饲料工业 2018年10期

■ 单春乔陈桂芳冯柳柳刘艳，江国托，*

(1.大连三仪动物药品有限公司，辽宁大连116036；2.江苏三仪生物工程有限公司，江苏邳州221300)

非淀粉多糖（Non-starch polysaccharides,NSP）是指植物中结构多糖的总称，主要包括纤维素、半纤维素、果胶类、抗性淀粉四部分，饲料原料不同，含有的NSP的种类和数量也不一样。玉米中主要NSP包括木聚糖、纤维素、β-葡聚糖，豆粕中NSP主要包括果胶、纤维素、甘露聚糖[1]。有研究发现，家禽饲粮中NSP含量达5%时，就会产生抗营养作用[2]。NSP酶主要由木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶组成[3]。

目前主要使用生物学法、离体消化法筛选特异性酶谱组合的复合酶制剂。用生物学法筛选复合酶制剂不仅费时费力，并且实验结果变化较大，而离体消化法应用于酶谱筛选中会达到事半功倍的效果[4]，并且有许多研究证明胃蛋白酶-胰酶两步法与体内真消化率有很高的相关性[5]。

近年来，传统饲料与现代动物营养学技术的结合愈加明显，在鸡饲粮中使用NSP酶已经非常普遍，但NSP酶在肉鸭饲粮中应用很少，主要关于肉鸭的NSP酶在我国的相关研究较少。NSP酶的作用效果受很多因素的影响，动物种类、饲养水平、酶的种类与水平等不同，效果差异较大。因此，针对饲粮的抗营养特性筛选与之适应的NSP酶对最大限度地利用饲料潜在还原糖的含量具有重要意义[6]。

为了探讨NSP酶中酶的组成与活性同肉鸭饲粮潜在可利用还原糖的关系，本实验以胃蛋白酶-胰液素两步酶水解法为手段，以酶水解物的还原糖含量为尺度，针对肉鸭饲粮中NSP的特性，筛选与之适应的酶谱，为NSP酶制剂在肉鸭饲粮中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验饲粮

本实验选用玉米-豆粕型肉鸭饲粮，肉鸭基础饲粮配制参照中华人民共和国肉鸭营养标准（2012）和NRC（1994）标准，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（饲喂基础）

1.1.2 酶制剂和酶活定义

本实验所用的主要酶制剂有：木聚糖酶（固体型，30万U/g）、β-葡聚糖酶（固体型，3万U/g）和甘露聚糖酶（固体型，5万U/g），购自广州亿添元生物科技有限公司。

木聚糖酶酶活的定义：在37℃和pH值5.5的条件下，每分钟从浓度为5 mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1 μmol的还原糖（以木糖计）所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。

β-葡聚糖酶酶活的定义：在37℃和pH值5.5的条件下，每分钟从浓度为4 mg/ml的β-葡聚糖溶液中分解释放1 μmol还原糖（以葡萄糖计）所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。

甘露聚糖酶酶活的定义：在37℃和pH值5.5的条件下，每分钟内从浓度为3 mg/ml的甘露聚糖溶液中分解释放1 μmol的还原糖（以甘露糖计）所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。

1.1.3 主要试剂

酶活底物葡聚糖（G6513-1G）、木聚糖（X4252-10G）、甘露聚糖（G0753-500G）购于Sigma公司；实验试剂胃蛋白酶（P7000）、胰液素（P7545-25G）购于Sigma公司；氯霉素（0230）购于Biotopped公司；氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；磺基水杨酸（分析纯）购于天津市光复科技发展有限公司。

1.1.4 主要仪器

万能粉碎机（上海比朗仪器有限公司）、大容量全温度振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）、磁力搅拌器（常州市金坛晨阳电子仪器厂）、紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、pH计（上海三信仪表厂）、真空抽滤泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计

按照表2的设计进行单因素实验，之后选取甘露糖酶、β-葡聚糖酶及木聚糖酶三个因素，每个水平1个重复，采用3因素3水平进行响应面设计，因素水平见表3，响应面实验方案见表4。

表2 单因素实验设计(mg/g)

表3 响应面设计因素(mg/g)

1.2.2 离体消化的准备

将饲料粉碎至一定粒度（过40目筛），放置阴凉干燥处密闭保存。将所需用的磷酸盐缓冲溶液、氢氧化钠溶液、盐酸溶液、磺基水杨酸溶液配好备用，实验所需的胃蛋白酶溶液、胰液素和氯霉素溶液在做实验前配制。

1.2.3 离体消化操作程序

离体消化的参数和离体消化程序参照赵峰的方法[7]，胃蛋白酶和胰液素酶的消化时间3～4 h最佳，水解温度为38℃，胃蛋白酶水解的最适pH值为2～3，胰液素酶水解的最适pH值为6.6，胃蛋白酶（P7000）、胰液素（P7545-25G）不是肉鸭的特异性酶，其中饲料添加量、pH值等消化参数做了具体调整。

表4 响应面实验设计方案表及实验结果

胃蛋白酶水解阶段：在1 000 ml烧杯中加入5 g过40目筛的饲料样品，加入0.2 mol/l pH值6.0的磷酸缓冲液75 ml，混合均匀后，加入0.2 mol/l HCl溶液，并调整溶液pH值至3.0，之后加入20 mg/ml胃蛋白酶盐酸溶液5 ml和0.5 mg/ml氯霉素乙醇溶液2.5 ml，按设计的添加量准确称取酶制剂置于烧杯中，将烧杯放在38℃恒温振荡器中，回旋频率为120 r/min，5 min后开始计时，震荡4 h。

小肠液酶水解阶段：待胃消化阶段结束后，向溶液中加入0.2 mol/l pH值6.6的磷酸盐缓冲液50 ml，用1 mol/l NaOH调整消化液的pH值至6.6，然后加入5 ml胰液素磷酸盐缓冲液（含18.5 mg胰液素），把烧杯放在38℃恒温震荡器中，回旋频率为120 r/min，5 min后开始计时，震荡4 h。

抽滤阶段：在消化残渣中加入25 ml 20%磺基水杨酸，在室温放置30 min，将烧杯中的残留物进行真空抽滤，最终将酶解液定容，并测定还原糖含量。

1.2.4 还原糖含量测定

酶解液中还原糖含量的测定采用DNS法进行测定。

1.2.5 数据统计与分析

利用EXCEL 2016对数据进行整理和分析，并做出相应的曲线图。然后用SPSS 16.0进行逐步回归分析，并对回归模型和回归系数进行显著性检验，从而建立酶制剂组成中每克饲料各NSP酶添加量X（mg/g）与酶解液还原糖含量Y（mg/g）间的回归方程。使用Design Expert 8.0对响应面的实验结果进行回归分析，得到NSP酶谱的最佳组合。

2 结果

2.1 NSP酶与还原糖含量测定结果（见图1～图3）

图1 木聚糖酶对肉鸭饲料木糖含量的影响

图1表示的是木聚糖酶与木糖之间的相关关系，从图1中可以看出，随着木聚糖酶添加量的增加，酶解液中木糖的含量先提高后下降，当木聚糖酶添加量为0.006 mg/g时，木糖含量最高，因此木聚糖酶的最适添加量确定为0.006 mg/g。

图2 β-葡聚糖酶对肉鸭饲料葡萄糖含量的影响

图2表示的是β-葡聚糖酶与葡萄糖之间的相关关系，从图2中可以看出，随着β-葡聚糖酶添加量的增加，酶解液中葡萄糖的含量先提高后降低，当β-葡聚糖酶添加量为0.005 mg/g时，葡萄糖含量最高，因此β-葡聚糖酶的最适添加量为0.005 mg/g。

图3表示的是甘露聚糖酶与甘露糖之间的相关关系，从图3中可以看出，随着甘露聚糖酶添加量的增加，酶解液中甘露糖的含量先提高后下降，当甘露聚糖酶添加量为0.018 mg/g时，甘露糖含量最高，因此甘露聚糖酶的最适添加量为0.018 mg/g。

图3 甘露聚糖酶对肉鸭饲料甘露糖含量的影响

2.2 非淀粉多糖酶添加量与还原糖含量之间的方程及相关参数

各种NSP酶的添加量与还原糖含量之间的三次相关方程见表5。

从表5可以知道，NSP酶与还原糖之间都存在显著（P＜0.05）的相关关系，而且还原糖含量与NSP酶的三次关系的相关度很高。

2.3 响应面法实验结果

根据表4的实验设计及结果，使用Design Expert 8.0对实验结果进行回归分析，得到以甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶为自变量，还原糖含量为响应值的二次多项回归方程。

表5 非淀粉多糖酶添加量与还原糖含量之间的方程

式中：Y——还原糖含量（mg/g）；

A——甘露聚糖酶浓度（mg/g）；

B——β-葡聚糖酶浓度（mg/g）；

C——木聚糖酶浓度（mg/g）。

依据回归方程利用软件Design Expert 8.0绘制响应面图，如图4所示。

响应面图能直观的反映实验参数与响应值的关系，其等高线图也能表明因素之间的交互作用。如图4所示，图（a）是以甘露糖酶和β-葡聚糖酶为变量生成的响应面图，方差分析中AB（P=0.523 3）大于0.05，表明甘露糖酶和β-葡聚糖酶之间有一定的交互作用。以甘露糖酶和木聚糖酶为变量生成的响应面图在图（b）中呈现，方差分析中 AC（P=0.667 6）大于0.05，表明其交互作用不显著。图（c）为β-葡聚糖酶和木聚糖酶为变量生成的响应面图，且方差分析中BC（P=0.727 4）大于0.05，表明β-葡聚糖酶和木聚糖酶之间交互作用不明显。之后对回归模型方差分析，结果见表6。

由表6知，整体模型显著（P＜0.05），失拟相不显著（P＞0.05），表明回归方程有较好的拟合程度。A（甘露聚糖酶）、B（β-葡聚糖酶）、C（木聚糖酶）、A2、B2和C2对结果有显著影响（P＜0.05）；AB、AC、BC交互项对实验结果无显著影响（P＞0.05）。

然后利用软件Design-Expert 8.0对方程模型进行分析，得到的最佳参数条件为A=0.015 mg/g，B=0.008 mg/g，C=0.007 mg/g，即甘露聚糖酶为0.015 mg/g、β-葡聚糖酶为0.008 mg/g及木聚糖酶为0.007 mg/g的添加水平，在此条件下，预测酶解液还原糖含量121.68 mg/g。在此条件下进行3次重复实验，得到还原糖含量为120.43 mg，与理论值的误差为1.03%，表明所得模型能反映出各因素对还原糖的影响。

图4 甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶对还原糖影响的响应面图

表6 回归模型的方差分析

3 讨论

本实验通过体外模拟法研究了β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶对肉鸭的饲料还原糖含量的影响，实验结果表明，肉鸭饲粮中，木聚糖酶的最适添加量确定为0.006 mg/g，β-葡聚糖酶的最适添加量为0.005 mg/g，甘露聚糖酶的最适添加量为0.018 mg/g。饲粮的最佳NSP酶酶谱为甘露聚糖酶为0.015 mg/g、β-葡聚糖酶为0.008 mg/g、木聚糖酶为0.007 mg/g的添加水平。

木聚糖是植物半纤维素的主要组成部分，是谷物籽实中的重要NSP之一，木聚糖抑制了谷物中的营养物质和动物消化液的反应，进而影响动物的消化吸收能力，降低了饲料的营养价值[8]。木聚糖酶可以对木聚糖进行专一分解，通过分解畜禽消化道中的木聚糖，降低食糜黏性，提高营养物质的消化吸收，降低畜禽下痢，因此促进了畜禽生长和提高饲料转化率[9]。张芹[10]研究发现在鸡饲粮中添加木聚糖酶和纤维素酶都可以提高鸡的消化能力，增加酶解液中还原糖的浓度，其中木聚糖酶的添加量在5 mg时，酶解液中还原糖浓度增加了10.85%，黏度降低了7.95%。结果表明，在体外条件下，酶制剂可有效的提高饲料的消化吸收，增加饲料的可利用养分。有研究表明，添加木聚糖酶可显著降低玉米、小麦和麦麸的抗营养因子的含量（P＜0.05），并显著的提高木糖的含量（P＜0.05），与本实验的实验结果一致[11-12]。

β-葡聚糖具有特殊的支链性结构，使分子折叠，持水力增加，引起肠道食糜黏度增加，通过网状结构的形成而吸收水分子，产生凝胶，从而改变了肠道的物理活性，降低了营养物质的消化吸收[13]。β-葡聚糖酶使β-葡聚糖对养分和内源消化酶的扩散抑制作用降低，饲料养分的消化率和吸收利用率提高[14]。侯小锋[15]报道，在玉米-豆粕型饲粮中添加外源酶制剂，体外模拟肉仔鸡消化过程，研究添加酶制剂对饲料体外消化的影响，结果发现，NSP酶制剂的添加能够促进饲料能量的离体消化率，提高饲料中葡萄糖的含量。Yu等[14]报道，采用NSP酶和蛋白酶为主的酶制剂对玉米-豆粕型饲料进行体外消化，结果表明，酶制剂能够促进饲料的消化，提高蛋白质的消化率，增加葡萄糖的含量。

NSP酶作为特异性降解饲料原料的消化酶添加在饲料中，从原理上讲可以实现分解NSP，从而提高饲料中营养物质的消化吸收能力。酶具有提高体内代谢激素水平、增强畜禽免疫力并降低可溶性NSP对畜禽内源酶的抑制等作用[16]。Meng等[17]报道，玉米-豆粕型饲粮中添加木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和半乳聚糖酶等NSP酶后，家禽饲粮的表观代谢能发生明显的增加（P＜0.05），同一添加量随饲粮中非常规饲料原料含量的提高，提高作用更趋于显著。丁斌鹰等[18]的研究发现，在40%稻谷型肉鸭饲粮中添加300～600 g/t稻谷专用酶制剂，可提高粗蛋白质的表观利用率2.20%～2.87%（P＜0.05），显著提高总磷表观利用率13.89%～23.23%（P＜0.05），极显著改善植酸磷的利用率21.59%～30.37%（P＜0.01），极显著提高粗纤维的利用率32.30%～92.68%（P＜0.01）。

饲料不同，酶作用的底物不同，所需要酶的种类和添加量也不同，因此，要充分发挥酶制剂的作用，必须根据饲料中的具体营养水平选择相对应的酶制剂[19]。本实验根据肉鸭饲料中的饲料组成确定了相应的NSP酶，提高了还原糖的含量，填补了NSP酶在肉鸭饲粮研究的空白，为NSP酶在肉鸭饲粮中的应用提供了研究数据，使肉鸭能更好的利用饲粮。