添加杜仲提取物及胆汁酸对凡纳滨对虾生长性能、免疫相关酶活性的影响

■李军涛 冼健安 陈惠琴 张秀霞 郑佩华 鲁耀鹏 王冬梅

(中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口571101)

杜仲是中国的的名贵滋补药材。饲料中适量添加有助于提高动物的生长性能、抗应激和抗氧化能力等[1-5]。在集约化养殖中，为了追求水产动物更高、更快的生长性能，饲料中脂肪的添加量越来越高，由于机体自身胆汁酸和胰脂肪酶分泌量不足，导致脂肪利用率很低，对动物体产生不良的影响。一方面过剩的脂肪容易被氧化，对机体产生毒害作用，另一面消化吸收不完全的脂肪进入肠道后段易被有害菌利用引起腹泻等肠道疾病。胆汁酸的添加可以有效的提高机体对脂肪的消化吸收、利用率等，从而降低饲料代谢能耗，节约成本。已有的研究表明，在畜禽饲料中添加胆汁酸，可以改善饲料品质、稳定饲料质量，达到提高生长性能、降低料肉比[6-9]，同时还可以畅通肠道，起到保肝护胆的作用。在水产动物方面，近年来国内外的学者已经在日本鳗鲡（Anguilla japonica）[10]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[11]、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）[12-13]等物种上开展研究。凡纳滨对虾是我国最广泛的海水虾类养殖品种，受水体污染加剧和高效配合饲料匮乏的限制，养殖成功率低下，其中的一个重要原因就是凡纳滨对虾相对简单的机体构造不足以应对剧烈的环境变化。本研究以杜仲提取物和胆汁酸为中草药添加剂，探究添加后对凡纳滨对虾的生长性能和免疫相关酶活性的变化。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

饲料采用的是海大集团凡纳滨对虾专用饲料作为基础饲料，分别添加0.3 g/kg的杜仲提取物对照组，(0.3+0.08)、(0.3+0.12)、(0.3+0.16)g/kg杜仲提取物和胆汁酸共3个添加梯度的试验组。配制饲料前先将杜仲提取物和胆汁酸充分溶解，采用梯度稀释的方法制作各个试验组饲料，将制好的饲料自然风干，分别储存在-20℃的冰箱中备用，饲喂前将饲料解冻至室温。

1.2 试验设计

在除日粮外的养殖系统、饲养条件等外界条件均相同的情况下，设置对照组和各试验组。正式试验开始前将虾苗暂养在3 m3圆形钢化玻璃缸中，并投喂基础饲料进行驯化饲养，待虾苗长到2.5 cm左右，选择体格健壮，无病无害，生长状况良好的虾苗随机分为4组，每组设置3个重复，每个重复30尾虾。试验开始时平均初始体重为(0.193±0.002)g，每箱的总重是(5.82±0.05)g。分箱后再用基础饲料暂养3 d，试验虾达到摄食的稳定状态后开始饲养试验。试验日粮按照虾总重的5%～8%投喂(日投饲量按照虾的摄食情况和水温具体制定)。

1.3 饲养管理

养殖试验是2017年5～7月在海南省澄迈县拔南村宝莱生物科技公司试验基地进行。养殖箱的规格为长×宽×高为50 cm×40 cm×40 cm，养殖箱水深25 cm左右，整个饲养期间保持水质稳定，水温控制在28～33 ℃，溶氧6.0 mg/l以上，pH值6.8～7.5，氨氮0.02～0.04 mg/l，亚硝酸盐0.02～0.04 mg/l，盐度 15‰～18‰。整个试验持续时间6周，每天7:00、11:00、15:00、19:00各投喂一次，每次投喂后40 min利用虹吸管收集残饵，在烘箱中70℃烘干，记录投喂量和残饵量。每天换水，换水量为整个养殖水箱的1/3左右，每两个星期称重一次，用来矫正投饲率。

1.4 样品采集和制备

养殖试验结束后，停食24 h，测定试验虾生长性能。测定各箱虾的总重并记录尾数，每箱虾随机抽取6尾，测量每尾虾的体长、体重，抽取血淋巴立即注入加有抗凝剂的Ep管中，并在冰盘上解剖分离肝胰脏和肠道并称取重量，所有样品立即放入液氮罐中，样品采集完成后，保存在-80℃冰箱备用。统计饲喂量、饵料系数、肥满度、肝体比、增重率、成活率。

1.5 测定指标

1.5.1 生长性能指标

1.5.2 免疫相关酶活性指标的测定

酶活性测定的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。酶活力的测定方法按照试剂盒的说明书测定。

1.6 数据分析

Excel初步计算后所有的试验数据利用SPSS17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan's法多重比较，试验结果均采用“平均值±标准差”的形式表示，P＜0.05表示差异显著。并用Origin 8.0作柱状图显示结果。

2 结果与分析

2.1 添加杜仲提取物及胆汁酸对凡纳滨对虾生长性能的影响（见表1）

表1 添加杜仲提取物及胆汁酸对凡纳滨对虾生长性能的影响

由表1可知，对照组的肥满度系数与其他各试验组差异不显著(P＞0.05)，随着胆汁酸添加梯度的增加，肥满度呈现出先上升后下降的趋势，但试验组均高于对照组，肥满度系数最高的是(0.3+0.08)g/kg组，结果是5.754%；对照组与各试验组的饵料系数没有出现显著差异(P＞0.05)，其中(0.3+0.12)g/kg组最小为1.402；试验组的肝体比明显低于对照组，差异显著(P＜0.05)，且(0.3+0.16)g/kg组显著低于(0.3+0.08)g/kg组，差异显著(P＜0.05)，与(0.3+0.12)g/kg组，差异不显著(P＞0.05)，(0.3+0.16)g/kg组肝体比系数最小为4.684%；各试验组的成活率均显著高于对照组(P＜0.05)。(0.3+0.12)、(0.3+0.16)g/kg组增重率高于对照组(P＜0.05)。综合以上各生长性能指标，研究发现各添加胆汁酸组均可以提高凡纳滨对虾的生长速度、增加可食用部分、提升成活率、降低饵料系数。基于生长性能的各指标，(0.3+0.12)g/kg的杜仲提取物与胆汁酸为最优添加组。

2.2 添加杜仲提取物及胆汁酸对凡纳滨对虾免疫相关酶活性的影响

2.2.1 添加杜仲提取物及胆汁酸对凡纳滨对虾溶菌酶活性的影响（见图1）

如图1所示，在血清中溶菌酶的活性对照组显著低于各试验组(P＜0.05)，各试验组之间差异不显著(P＞0.05)，溶菌酶活性最高的是(0.3+0.08)g/kg组，达到了5.93 U/ml，杜仲提取物与胆汁酸共同添加后，可以明显的提高凡纳滨对虾血清中溶菌酶的活性；在肝脏中，对照组的溶菌酶活性显著低于(0.3+0.12)、(0.3+0.16)g/kg组(P＜0.05)，与(0.3+0.08)g/kg组差异不显著(P＞0.05)，溶菌酶活性最高的两组依次是(0.3+0.16)、(0.3+0.12)g/kg 组，分别达到1.256、1.250 U/ml。基于溶菌酶在肝脏和血清两个组织中的酶活性，(0.3+0.12)g/kg杜仲提取物与胆汁酸共同添加是较优的添加梯度。

图1 肝脏和血清中的溶菌酶活性及显著性变化

2.2.2 添加杜仲提取物及胆汁酸对凡纳滨对虾丙二醛(MDA)含量的影响（见图2）

由图2所示，血清中，(0.3+0.08)、(0.3+0.12)g/kg组MDA水平分别为5.397、5.342 nmol/ml，显著低于对照组和(0.3+0.16)g/kg组(P＜0.05)；在肝脏中，(0.3+0.12)g/kg组的MDA水平显著低于对照组(P＜0.05)，其他组间差异不显著(P＞0.05)，MDA水平最低的(0.3+0.12)g/kg组含量为5.342 nmol/ml，添加胆汁酸能有效的降低MDA水平。MDA水平的高低反映自由基对机体的损伤情况，所以(0.3+0.12)g/kg组的凡纳滨对虾健康程度最好，为杜仲提取物与胆汁酸共同添加是较优的添加梯度。

图2 肝脏和血清中的MDA含量及显著性变化

2.2.3 添加杜仲提取物及胆汁酸对凡纳滨对虾过氧化氢酶(CAT)活性的影响（见图3）

图3 肝脏和血清中的CAT活性及显著性变化

图3可知，在血清中凡纳滨对虾CAT的活性，对照组与各试验组都没有出现显著性差异(P＞0.05)，(0.3+0.12)g/kg组的活性明显高于(0.3+0.16)g/kg组，差异显著(P＜0.05)，与(0.3+0.08)g/kg组差异不显著(P＞0.05)，CAT 活性最高的(0.3+0.12)g/kg组达到4.59(U/mg prot.)；在肝脏中，对照组与各试验组没有出现显著性差异(P＞0.05)，(0.3+0.12)g/kg组的活性明显高于(0.3+0.16)、(0.3+0.08)g/kg组，差异显著(P＜0.05)，其他组间差异不显著(P＞0.05)，CAT活性最高的(0.3+0.12)g/kg组达到6.62(U/mg prot.)，CAT是过氧化物酶体的标志酶，代表机体的抗氧化能力。基于CAT活性在肝脏和血清两种组织的共同变化，最佳在添加量为(0.3+0.12)g/kg杜仲提取物和胆汁酸共同添加组。

2.2.4 添加杜仲提取物及胆汁酸对凡纳滨对虾酚氧化酶(phenoloxidase，PO)活性的影响（见图4）

图4 血清中的PO活性及显著性变化

由图4可知，对照组与其他试验组间差异不显著(P＞0.05)，(0.3+0.12)g/kg组明显高于(0.3+0.08)g/kg组，差异显著(P＜0.05)，PO是在氧分子存在条件下，能把酚类氧化成邻苯醌或对一苯醌的酶，减少动物体受到酚类物质对机体的损害，(0.3+0.12)g/kg组的PO活性最高，达到3.82 U/mg，为该条件下较合适的添加量。因此，结果表明在(0.3+0.12)g/kg的杜仲提取物和胆汁酸共同添加较合适。

2.2.5 添加杜仲提取物及胆汁酸对凡纳滨对虾谷草转氨酶(GOT/AST)、谷丙转氨酶(GPT/ALT)活性的影响（见图5）

图5 肝脏中的GOT、GPT活性及显著性变化

由图5可知，对照组GOT活性显著低于试验组(P＜0.05)，其他组间差异不显著(P＞0.05)，GOT活性的高低反映动物体肝脏的健康程度，其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致；对照组、(0.3+0.12)g/kg组的GPT 活性显著低于(0.3+0.08)、(0.3+0.16)g/kg组(P＜0.05)，(0.3+0.16)g/kg组显著低于(0.3+0.08)g/kg组(P＜0.05)。因此，本研究结果表明在(0.3+0.12)g/kg的杜仲提取物及胆汁酸添加量较合适。

3 讨论

3.1 添加杜仲提取物和胆汁酸对凡纳滨对虾生长性能的影响

已有的研究表明饲料中添加杜仲提取物，可以有效的提高水产动物的生长性能。季延滨等[14]报道，对中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis Milne-Edwards)投喂添加1%的杜仲提取物2周后，试验组的肥满度明显高于对照组，差异显著(P＜0.05)；刘波等[15]研究发现凡纳滨对虾经过42 d养殖试验，2.0%杜仲组的虾体增重率最高(136.1%)，饲料系数最低(1.33)，差异显著(P＜0.05)。鲤鱼(Cyprinus carpio)[16]、罗氏沼虾[17]等的研究得到类似的结果；本次试验中研究发现添加胆汁酸能够提高凡纳滨对虾的成活率、增重率，降低饵料系数，这与周书耕等[18]在军曹鱼(Rachycentroncanadum)饲料中添加0.03%胆汁酸与对照组相比能降低饵料系数，提高增重率结果一致。胡田恩等[19]研究发现在牛蛙[Rana(Lithobates)catesbeiana]饲料中添加200 mg/kg的胆汁酸不仅可以提高特定生长率、蛋白利用效率等指标，还可有效的降低牛蛙的脏体比和全体的脂肪率。本次试验中各试验组的的肝体比指数明显低于对照组。对齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)的研究发现，随着饲料中胆汁酸添加水平的不断提高，增重率、特定生长率、蛋白利用效率等指标呈现出先上升后趋于稳定的趋势，饵料系数则为先下降后趋于稳定[20]。这与此次试验得到的变化趋势接近。此外在加州鲈(Micropterus salmoides)[21]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼[22]、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)[23]的养殖试验中得到结果类似。可能的原因是：一方面添加胆汁酸后，有效的提高了凡纳滨对虾对饲料的利用率。对吉富罗非鱼(tilapia)[24]的研究发现，饲料添加胆汁酸能够显著提高脂肪酶、蛋白酶的活力，草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[25]饲料中添加胆汁酸后肠道各段及肝胰脏的消化酶活性均随添加量的增加呈先升高后下降的趋势。另一方面添加胆汁酸能够改变凡纳滨对虾肠道内的微生物菌群系统。对饲喂胆汁酸的各组草鱼肠道微生物16S rRNA进行宏基因组测序，结果表明会降低草鱼肠道微生物的多样性，有害菌丰度降低，可能通过调控菌群分布达到提高消化能力。第三，本次试验中杜仲提取物和胆汁酸共同添加，两者都有提高生长性能的表现，两者的交互作用可能进一步发挥功效，为研制高效绿色配合饲料提供理论支撑。

3.2 添加杜仲提取物和胆汁酸对凡纳滨对虾免疫相关酶活性的影响

凡纳滨对虾属于节肢动物们无脊椎低等生物，没有完整的免疫系统，主要依靠自身的非特异性免疫抵抗细菌、病毒等有害物质，血清和肝脏的溶菌酶含量能够在一定程度上反映非特异免疫的水平。张玲等[26]研究发现，鲤鱼饲料中添加胆汁酸可以显著提高溶菌酶的活性(P＜0.05)。本试验中血清中溶菌酶含量各试验组明显高于对照组，差异显著(P＜0.05)，肝脏中，对照组的溶菌酶活性显著低于(0.3+0.12)、(0.3+0.16)g/kg组，差异显著(P＜0.05)，可能的原因是添加了胆汁酸后，促进了凡纳滨对虾的非特异性免疫，增加了对溶菌酶的分泌。陈科全等[25]在研究草鱼饲料添加胆汁酸的试验中通过测定肝脏、肠道、血清的MDA含量，认为胆汁酸是维持肝-肠循环途径健康的重要成分。本试验中测定添加杜仲提取物及胆汁酸对凡纳滨对虾丙二醛(MDA)含量，血清中添加(0.3+0.12)、(0.3+0.08)g/kg组MDA水平低于对照组，差异显著(P＜0.05)；在肝脏中，(0.3+0.12)g/kg组的MDA含量显著低于对照组，差异显著(P＜0.05)，可能的原因是添加胆汁酸后有效的抑制了MDA等有害物质对血清和肝脏的排放。李莉等[27]通过给小鼠注射MDA，发现代谢途径是由血液流向肝脏，说明体内的自由基、MDA等有害物质对动物体的多个器官组织造成损伤[28]，危害巨大。CAT、PO是反映机体抗氧化、氧化机体有害物质能力的酶，是酶免疫系统的重要组成部分[29]。正常情况下，GPT、GOT在心肌细胞中含量最高，其次为肝脏，血清中含量极少。在肝脏中，主要存在于肝细胞线粒体内，是蛋白质代谢的动力酶[30]。本试验各试验组肝脏GOT活性显著高于对照组，(0.3+0.08)、(0.3+0.16)g/kg组GPT显著高于对照组，这与Maria A等[31]报道添加胆汁酸能够增加肝细胞内的氨基酸利用率。因此，添加一定量的胆汁酸可以一定程度上提高对凡纳滨对虾免疫相关酶的活性，增强非特异免疫。由酶的种类、个体差别等因素，酶的活性变化存在不同步的差异。

4 结论

本试验主要在凡纳滨对虾的生长性能和免疫相关酶的活性方面进行探讨，旨在确定杜仲提取物及胆汁酸的添加量。基于生长性能的各指标，(0.3+0.12)g/kg杜仲提取物与胆汁酸添加组为最优添加组。由于免疫相关酶种类的不同及活性在不同组织中的差异性，试验结果有较大差异，综合考虑，试验认为(0.3+0.12)g/kg杜仲提取物与胆汁酸添加组为最优添加组，这与生长性能评价的结果一致。