共轭亚油酸对草鱼肠道炎症的调节作用

2019-01-02余登航常家智董桂芳

饲料工业 2018年10期

■余登航常家智董桂芳

(武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉430023)

肠道炎症反应是高密度集约化养殖鱼类常见的疾病症状，常给养鱼造成巨大的损失，该疾病主要是由病原菌感染所引发[1-3]。此外，饲料中的营养成分，如豆粕也可以导致鱼类肠道炎症反应[4-6]。肠道炎症反应发生以后，轻微者可引起鱼类行动缓慢，食欲不振，影响鱼类正常生长；严重者则引起鱼类腹部肿胀，肠道充血，引起鱼类大量死亡。

共轭亚油酸（CLA）是亚油酸（含有共轭双键）的一类空间位置和几何异构体的总称，主要有cis-9,trans-11CLA（c9t11-CLA）和 trans-10，cis-12CLA（t10c12-CLA）两种异构体。研究表明，在人类、小鼠和猪等哺乳动物中，CLA在活体和细胞水平都具有抗炎作用[7]。目前为止，关于CLA对草鱼肠道炎症调控作用的报道很少。因此，本论文拟通过在草鱼饲料中添加适量的共轭亚油酸，探讨其对草鱼肠道炎症的调控作用，为草鱼饲料配方的优化升级提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

基础日粮组成和营养水平见表1，参照本课题组前期研究结果[8]，在基础饲料中用2%的共轭亚油酸（青岛奥海生物有限公司，43.8%c9t11-CLA和47.3%t10c12-CLA）替代等量豆油配制试验饲料（CLA组）。手工将饲料原料混合均匀，制成直径2.0 mm的颗粒饲料，45℃的恒温干燥，使饲料水分含量小于10%，然后-20℃保存待使用。

1.2 试验鱼与饲养

试验草鱼购于武汉市柏泉农场草鱼养殖基地，并在武汉市水产科学研究所的养殖基地中完成养殖试验。试验分为三个组（阳性对照组、阴性对照组及CLA组），其中阳性对照组和阴性对照组用对照组饲料投喂，CLA组草鱼使用试验组饲料喂养，将试验鱼养殖在网箱中，每个网箱随机分配30尾草鱼（7 g/尾左右），每个试验组有三个重复，共计9个网箱。养殖周期为35 d，养殖周期内，水温为25～30℃，pH值约为8，溶氧约为7.7 mg/l。

表1 基础日粮组成及营养水平(%干物质)

1.3 样品采集

养殖第28 d，将草鱼在MS-222溶液（浓度为60 mg/l）中浸泡10 min麻醉后，根据赵杰等[9]的描述的方法诱导草鱼肠道炎症。具体操作如下：用注射器插入肛门上端3 cm进行注射，CLA组和阳性对照组（TNBS组）注射0.05 ml三硝基苯磺酸(TNBS)乙醇混合溶液(浓度为2.5%)，阴性对照组(PSS组)注射等体积的0.7%生理盐水(PSS)。于注射后24 h后，随机选取6尾草鱼并分离后肠，匀浆离心后测定炎性损伤相关指标，细胞因子IL-1β、IL-8及TNF-α的含量用商品试剂盒（北京冬歌生物科技有限公司）测定，髓过氧化物酶（MPO）的活性用商品试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。剩下的鱼于注射后第1、3、7 d观察、解剖并记录鱼体运动，体表损伤以及肠道损伤情况，具体评判标准见表2。

表2 肛门灌注TNBS后草鱼大体形态与组织损伤评分[9]

1.4 数据分析

试验数据用SPSS16.0软件包(SPSS，Michigan Avenue，Chicago，IL，USA)进行方差分析，用Tukey’s单因素方差分析法检验组间差异，P＜0.05表示有显著性差异，结果用“平均数±标准差”表示。

2 结果

2.1 鱼体运动、体表损伤以及肠道损伤情况

由图1可见，注射TNBS 24 h后，TNBS组鱼体出现体表充血严重及鳞片脱落等症状；CLA组仅出现肛门充血；PSS组则表现正常。

由表3可见，肛门注射TNBS后各组草鱼均出现临床症状，症状于第3 d最为严重，随后于第7 d缓解。与对照组相比，饲料中添加CLA可以缓解TNBS诱导的草鱼损伤的临床症状。

图1 TNBS诱导肠道炎症24 h后各试验组体表损伤情况

表3 CLA对TNBS诱导的草鱼炎性损伤临床症状影响(评分)

2.2 各组肠道炎症相关指标

试验结果表明，饲料中2%CLA可显著降低TNBS诱导的肠道炎性细胞激活的标志——髓过氧化物酶（MPO）的活性（图2）以及炎性细胞因子（IL-1β、IL-8和 TNF-α）的含量（图3）。

图2 注射TNBS 24 h后草鱼肠道组织MPO活性

图3 注射TNBS 24 h后草鱼肠道组织炎性细胞因子含量

3 讨论

长期以来，有关CLA在鱼类上的研究多集中在CLA对鱼类的摄食、生长和组织CLA沉积等营养生理的影响[10]以及组织脂肪代谢的影响[11]，而对CLA在鱼类中发挥抗炎功效的报道很少。本文发现CLA对草鱼肠道炎症有一定的调控效果，这可能与CLA是过氧化物酶体增殖物活化受体PPARγ的天然配体有关。我们前期研究发现，在草鱼饲料中，随着CLA添加水平升高，草鱼肠道中PPARγ基因表达量显著提高，CLA含量为2%时PPARγ基因表达量达到最大值，且并未对草鱼生长造成不良影响[8]。

炎性细胞因子基因的表达是在转录因子核因子NF-κB调节下启动的[12]，活化的NF-κB从胞浆转位到胞核，促进炎性细胞因子基因的转录[13]。在鱼类上的研究也同样表明NF-κB在炎性细胞因子（如IL-1β和TNF-α）的基因的表达中起到核心调节作用[14]。在细胞处于静息状态时中，NF-κB与抑制因子（IκB）结合以无活性形式存于细胞质。在炎症反应中，IκB激酶（IKK）促使IκB磷酸化，导致NF-κB与IκB解离。解离的NF-κB在核内与DNA特定的κB序列结合，诱导炎性细胞因子基因表达与转录[15]。PPARγ被CLA激活后可以抑制NF-κB的活性从而抑制调控炎性细胞因子基因的表达，其作用机制与NF-κB抑制因子IκB相似[16-17]。

研究表明，CLA可以通过激活PPARγ途径调节炎症反应。Yu等[18]使用CLA处理巨噬细胞，发现CLA异构体混合物能降低细胞因子如IL-1和IL-6的生成，认为CLA具有抗炎症反应至少是部分依赖于过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的调节，Yang等[19]也发现cis-9,trans-11 CLA具有类似的作用。Bassaganya-Riera等[20]的研究表明，CLA可以通过激活猪结肠PPARγ降低炎性因子TNF-α的产生，从而调控结肠炎的发作时间及损伤程度。