非淀粉多糖酶对黄羽肉仔鸡生长性能、养分利用率及盲肠微生物多样性的影响

2019-01-02周响艳战晓燕董泽敏冯定远

饲料工业 2018年10期

■孙皓戴炜周响艳战晓燕张涛叶慧董泽敏冯定远*

（1.华南农业大学动物科学学院，广东广州510642；2.上海农林职业技术学院，上海201699；3.赢创德固赛(中国)投资有限公司，北京 100600）

近年来，随着畜禽业的迅猛发展，玉米作为主要的能量饲料，价格持续走高。而我国小麦资源丰富，价格比玉米低，其蛋白质、烟酸、赖氨酸等含量比玉米高，因而开发小麦饲粮具有一定的现实意义和较高的经济价值。然而小麦中含有大量非淀粉多糖（nonstarch polysaccharides，NSP），单胃动物消化道内缺乏消化这类多糖的内源酶，故这些物质不能被有效消化利用[1-2]。因此促进小麦中非淀粉多糖的降解成为一个研究方向。已有研究表明，在小麦饲粮中添加以木聚糖酶为主的NSP酶制剂，可以消除NSP的抗营养作用，提高小麦营养价值和动物生产性能[3-5]，因此饲料用酶制剂的开发和应用已成为现代饲料工业和现代养殖业不可缺少的重要组成部分，而酶制剂正确合理地使用，可以有效缓解饲料资源紧缺的现状。本试验在小麦型饲粮中添加不同复合酶制剂（复合酶组成为：木聚糖酶、β-葡聚糖酶），研究其对黄羽肉仔鸡生长性能、养分代谢率和盲肠微生物的影响，探讨复合酶制剂对肉仔鸡的营养效应，以期为肉仔鸡养殖过程中合理有效地利用复合酶制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验复合酶由溢多利酶制剂公司技术研发部提供，主要由木聚糖酶、β-葡聚糖酶等组成，其中复合酶A中木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶活力分别为15 000 U/g和2 000 U/g；复合酶B中木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶活力分别为10 000 U/g和1 000 U/g。

1.2 试验日粮

饲养试验饲粮参考NRC（1994）肉鸡的营养需要，并结合养殖场饲粮组成标准进行配制。日粮组成及营养水平见表1。

表1 试验日粮配方和营养水平(风干基础)

1.3 试验设计与饲养管理

试验采用单因子随机分组试验设计，选择1日龄的健康黄羽肉雏鸡（雄性）1 440只，随机分成4个处理组（见表2），每组6个重复，每个重复60只。饲养试验持续21 d。

表2 试验分组情况

2 测定指标与方法

2.1 肉鸡生长性能

记录试验前体重，每天观察鸡的健康状况，每周称量鸡的活体重和余料重量，统计肉仔鸡的平均日采食量、平均日增重和料重比。

2.2 代谢试验

2.2.1 试验分组

采用全收粪法。试验选用60只成年公鸡，随机分成5组，每个处理组6个重复，每个重复2只鸡。其中一组为内源组，其他4组分别为正对照组、负对照组、复合酶A组、复合酶B组。用试验饲粮预饲3 d，然后连续收集4 d粪样。粪样收集后按每100 g鲜样加10%硫酸5 ml、滴加5滴甲苯防腐，混匀并置于-20℃冰柜中保存，用于干物质代谢率、能量代谢率和粗蛋白质代谢率测定。

2.2.2 测定指标及方法

饲料、粪样和食糜的测定指标有干物质、总能、粗蛋白质和粗纤维；总能、摄入饲料能值、排泄物能值采用燃烧法，用长沙仪器厂生长的WGR-1G微电脑煤质测定处理仪测定；粗蛋白质采用凯氏微量定氮法，用FOSS 2300 KJELTEC ANALYZER UNIT自动定氮仪测定。

2.3 屠宰试验

饲养试验结束后（鸡已停料12 h），以重复为单位，每个重复取体重接近平均水平的2只试验鸡（共48只）。取腺胃、肌胃（去除内容物）、心脏、肝脏和胰脏迅速称其鲜重并计算内脏器官指数。体表消毒后取整段盲肠，液氮中保存备用。

内脏器官指数(%)=内脏器官鲜重(g)/体重(g)×100

2.4 盲肠微生物区系

试验时取盲肠中部约2 cm，截取1 cm用于试验，采用EZgeneTM Bacterial gDNA Kit（Biomiga，USA）试剂盒提取DNA。利用细菌通用引物（由上海生物工程有限公司合成）扩增16S rDNA的V6～V8区片段。PCR上游引物为带有GC夹子的U968-GC-f：5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’，下游引物(L1401r)：5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。扩增程序为94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35循环；72 ℃10 min，PCR产物采用BIO-RAD DCodeTM Universal Mutation Detection System进行DGGE电泳检测，并用Bio-Rad公司的Quantity one软件进行分析。

2.5 数据统计处理

试验结果采用“平均数±标准误”表示，用SPSS 17.0软件进行数据分析，各指标差异显著性分析用One-way ANOVA进行分析，用LSD法进行多重比较。

3 结果与分析

3.1 复合酶对黄羽肉仔鸡生长性能的影响（见表3）

表3 复合酶对1～21日龄黄羽肉仔鸡生长性能的影响

由表3可知，1～21日龄时，复合酶B组试验鸡平均日采食量最低，正对照组最高，各组间差异不显著（P＞0.05）；负对照组、复合酶B组试验鸡的平均日增重与正对照组差异显著（P＜0.05），复合酶A组比负对照组提高了4.11%，但差异不显著（P＞0.05）；正对照组试验鸡的料重比最低，负对照组最高，负对照组、复合酶B组与正对照组差异显著（P＜0.05），复合酶A组比负对照组降低了2.83%，但差异不显著（P＞0.05）。

3.2 复合酶对黄羽肉仔鸡内脏器官发育的影响(见表4)

由表4可知，1～21日龄，负对照组试验鸡的心脏重量最低，复合酶B组最高，复合酶B组比正对照组和负对照组分别提高了13.02%、24.03%，差异显著（P＜0.05），复合酶A组比负对照组提高了22.73%，差异显著（P＜0.05）；其他各组之间差异不显著（P＞0.05）。各组间的肝脏、脾脏和腺胃重量差异均不显著（P＞0.05）。复合酶B组试验鸡的胰腺重量与正对照组差异显著（P＜0.05）；其它各组之间差异不显著（P＞0.05）。复合酶A组试验鸡肌胃重量比正对照组和负对照组分别提高了13.88%、18.52%，差异显著（P＜0.05）；其它各组之间差异不显著（P＞0.05）。

表4 复合酶对黄羽肉仔鸡内脏器官重量及指数的影响

复合酶A组、复合酶B组试验鸡心脏指数分别与正对照组和负对照组均差异显著（P＜0.05）。正对照组试验鸡的肝脏指数与负对照组差异显著（P＜0.05），其他各组差异不显著（P＞0.05）。各组之间的脾脏指数和胰腺指数差异均不显著（P＞0.05）。复合酶A组试验鸡的肌胃指数比正对照组和负对照组分别提高了19.54%、15.24%，差异显著（P＜0.05），复合酶B组与正对照组差异显著（P＜0.05）。复合酶B组试验鸡的腺胃指数比正对照组提高了16.05%，差异显著（P＜0.05）；其他各组之间差异不显著（P＞0.05）。

3.3 复合酶对营养物质消化代谢率的影响（见表5）

由表5可知，复合酶A组、复合酶B组饲料中干物质表观消化率比负对照组分别提高了3.93%、2.29%，差异不显著（P＞0.05）；复合酶A组的粗蛋白质真代谢率比负对照组提高了47.63%，差异极显著（P＜0.01），复合酶B组比负对照组提高了21.34%，但差异不显著（P＞0.05）。复合酶A组、复合酶B组的能量代谢率比负对照组分别提高了2.75%、1.55%，但差异不显著（P＞0.05）。

表5 复合酶对饲料中营养物质代谢率的影响(%)

3.4 复合酶对盲肠微生物的影响（见图1、图2）

图1 盲肠微生物DGGE电泳图谱

从图1、图2中可以看出，样品经过变性梯度凝胶电泳之后，都可以分离出数目不等的电泳条带，各处理组之间至少有3条共同的条带，即同有菌。另外，加酶组也出现了自己独有的条带，即独有的优势菌种。同时，同一组内的三条泳道的条带的位置和数目也不相同，说明不同鸡个体间肠道微生物菌群也存在一定差异。对DGGE电泳条带进行统计见表6，由表6可知，正对照组试验鸡的盲肠微生物DGGE电泳条带数目最少，复合酶B组最多，两复合酶组分别比正对照组提高了14.27%和14.59%，均差异极显著（P＜0.01）；复合酶B组比负对照组提高了6.72%，差异显著（P＜0.05）；复合酶A组比负对照组提高了6.43%，有显著性趋势（P=0.06）。

4 讨论

4.1 复合酶对肉仔鸡生长性能的影响

非淀粉多糖根据水溶性分为不溶性非淀粉多糖（insoluble non-starch polysaccharides，INSP）和水溶性非淀粉多糖（soluble non-starch polysaccharides，SNSP）。无论INSP还是SNSP对动物生长性能的都有极大的影响，主要体现在阻碍饲料原料细胞内营养物质的释放，抵制消化酶活性和增加食糜黏度[6]。研究表明，饲粮中添加NSP酶制剂可以有效破坏NSP的结构，从而降低NSP抗营养作用，提高动物的生长性能[7-8]。本试验中，负对照组比正对照组能量降低了0.61 MJ/kg（降低了5%），在负对照组饲粮中添加复合酶不同程度地提高了黄羽肉仔鸡的生长性能，与前人通过添加复合酶提高动物生长性能结果一致[7]。

图2 盲肠微生物DGGE电泳条带示意图

表6 复合酶对盲肠微生物DGGE电泳条带的影响

4.2 复合酶对内脏器官发育的影响

饲粮的营养状况会直接影响鸡的体型参数和内脏器官的发育，而内脏器官的发育情况会直接影响到鸡对营养物质的消化吸收、体重的增加以及屠宰性状的改善。NSP溶解使肠道食糜黏度和体积增加，刺激消化腺的增生以增加消化酶的分泌量，动物机体作出代偿性的生理反应，增加消化器官的负担导致动物胰脏、肝脏的增大。Ikegami等[9]表明，长期饲喂含NSP的日粮可增加消化液的分泌，使消化器官代偿性增大。日粮中添加酶制剂后可以消除NSP所带来的负面效应，改善内脏器官的发育。王金全[7]报道，与小麦基础饲粮组相比，添加木聚糖酶后胰脏相对重量降低13%，其它消化器官相对重量有降低趋势但差异不显著。本试验中，加酶组比正常饲粮降低了0.61 MJ/kg的能量，并且添加了小麦22.34%和小麦麸7.52%，从而增加饲粮粗纤维含量，但是从试验结果我们可以看出，大多数内脏器官重和器官指数与正负对照组差异均不显著（P＞0.05），并且加酶组的数值大部分都在负对照组与正对照组之间，比负对照组效果要好，但比正对照组效果稍微差一点，说明加酶能改善非常规饲料（小麦、小麦麸）的营养，小麦+复合酶能部分替代玉米。其中复合酶A组比复合酶B组的效果要好。

4.3 复合酶对饲粮营养物质代谢率的影响

研究表明，复合酶能提高饲粮营养物质消化代谢率，原因可能在于酶制剂对饲粮中抗营养因子的破坏作用[10-12]。玉米、豆粕、菜籽粕、小麦等常用植物性饲料原料细胞壁中NSP含量均较高，复合酶制剂中所含的NSP酶能破坏细胞壁结构，促进细胞壁崩解，使细胞壁包裹的各种营养物质充分释放出来，与畜禽肠道内的消化酶充分接触，从而提高各种养分的消化率。同时，酶制剂能消除SNSP对内源性消化酶的抑制作用。有研究报道SNSP可抑制消化道中淀粉酶、二糖酶和脂肪酶的活性。本次试验，两组复合酶制剂对干物质表观消化率、粗蛋白质真代谢率、能量代谢率都有不同程度的提高，其中复合酶A组的效果要好于复合酶B组，复合酶A组的粗蛋白质真代谢率比负对照组提高了47.63%，差异极显著（P＜0.01），其它的均差异不显著。这有可能是因酶制剂种类和数量以及做代谢试验的动物有差异所造成的试验结果不一致。

4.4 复合酶对盲肠微生物区系的影响

动物肠道微生物复杂多样，形成一个相对稳定平衡的微生态系统，对其生长和健康起着非常重要的作用。NSP可以通过肠道微生物间接发挥其抗营养作用。NSP抑制了养分的消化和吸收，未能在小肠内消化和吸收的养分进入到后肠道，导致营养物质在后肠道内的蓄积，温暖湿润富含养分的食糜是细菌特别是致病菌理想的培养基，利于细菌的大量繁殖；高黏度的食糜通过消化道的速度降低，菌群移动减慢，为细菌生长繁殖提供了一个稳定的环境。此外，高黏度的食糜使消化道内的氧气减少，利于厌氧微生物的生长，细菌大量繁殖并刺激肠道，增厚肠道黏膜，损害微绒毛，加剧宿主和细菌之间的竞争[13]。传统培养法一般采用选择性培养基通过倍比稀释及菌落计数，将各种菌分离和鉴定。它可在菌株水平测定活菌含量，较直观，计数简单，方便实用，但只能研究比较容易培养的微生物。随着分子生物学技术的发展，基于16S rRNA、18S rRNA分子技术促进了动物体内微生物研究的发展，尤其是被称为DNA指纹技术的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）研究微生物多样性以来，受到越来越多科学工作者的关注。变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术是一种利用不同DNA片段解链特性和梯度变性胶（由尿素和甲酰胺组成的变性剂的浓度不同）的特性，在聚丙烯酰胺凝胶电泳时将不同DNA片段分离开来的系统，可检测只有一个碱基差异的DNA片段。该技术是最早在医学上用于检测基因突变的，近年来PCRDGGE也开始用于肠道菌群的微生态研究[14-15]。本试验利用该技术对小麦型饲粮添加复合酶制剂对盲肠菌群变化进行了研究。从表6可以看出，两个加酶组显著提高了电泳条带数，说明了酶制剂的添加影响了肠道菌群的建立，增加了一些优势菌群的种类。一方面由于添加酶后，致使食糜黏度降低，肠道运动加速，从而缩短食糜在消化道的停留时间，防止蛋白质、糖类、脂肪在肠道的过度发酵，使大量病原菌的繁殖条件不能建立而减少了后肠道有害微生物的数量，增加了一部分有益菌的种类和数量；另一方面可能是酶降解非淀粉多糖成寡糖所引起的，Catala等[16]研究报道，多数寡糖对宿主的保健作用主要是通过促进有益菌的生长来实现的。还有一些寡糖还能够有效清除或减少部分黏附到肠腔的病原菌。另外，同一组内的样本虽然存在共有菌，但组内相似性整体不高，都低于85%，说明组间个体间差异较大，并不能严格反映酶对其菌群变化的影响，此外，DGGE技术本身的局限性对实验也有一定的影响，DGGE只能检测到细菌总数超过1%的菌群[17]，所以样品中尚有一些细菌未能充分反映。