微生态制剂通过提高肠道屏障功能改善蛋鸡生产性能和蛋品质

2019-01-02吴昌征付大波罗文祥周培源

饲料工业 2018年8期

■吴昌征付大波张伟罗文祥周培源郭亮杨倩周樱*

（1.上海纵和横营养技术有限公司，上海200000；2.武汉新华扬生物股份有限公司，湖北武汉430000；3.南京农业大学动物医学院，江苏南京210000）

肠道是机体最大的消化和免疫器官，其结构的完整性对动物生长和健康影响重大。益生菌可减少肠道炎症，维持和恢复肠道屏障功能（杨桂连等，2015；李旌等，2017）；可缓解炎症造成的肠道损伤程度，上调肠黏膜紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达，改善了肠道屏障功能（曹力等，2014；张俊等，2016）。微生态制剂可改善肠道菌群平衡、预防和治疗疾病、促进动物生长和饲料转化率，可作为抗生素较理想的替代品（王秋菊等，2014），还具有减少环境污染和提高畜禽产品质量的优点，近年来在畜禽生产中的应用越来越广泛（徐晨希等，2017）。但是，微生态制剂如何通过改善肠道的通透性功能和紧密连接屏障功能来提高蛋鸡的生产性能目前报道不是很多，因此本试验研究不同梯度微生态制剂对蛋鸡生产性能、蛋品质和肠道屏障功能的影响，为微生态制剂的应用和蛋鸡肠道健康调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

微生态制剂由武汉新华扬生物股份有限公司提供，其主要成分为屎肠球菌、丁酸梭菌等。

41周龄健康海兰灰蛋鸡饲养于武汉新华扬生物股份有限公司团风养殖基地蛋鸡舍内。

试验日粮和营养水平参照美国NRC（1994）蛋鸡营养标准配制成全价粉状料，饲料中未添加任何抗生素，基础日粮组成及营养成分见表1。

表1 饲料组成与营养水平（风干基础）

1.2 试验动物及试验设计

试验采用单因子试验设计，选取41周龄产蛋率相近，体重差异不显著的健康海兰灰蛋鸡288只，按体重相近原则随机分为4个处理组，每个处理组6个重复，每个重复12羽。分别在基础日粮中添加0、25、50 g/t和100 g/t的微生态制剂。饲养试验为期10周，其中预试期2周，正试期8周，预试验期间，观察蛋鸡的产蛋率，并对各组进行调整，使各组间产蛋率无统计学差异。

1.3 试验动物饲养管理

鸡舍为三层层叠式笼养（3只/笼，4笼/重复），采用人工光照和自然光照相结合的方式，每天保持16 h光照（05:00～21:00），光照强度10～15 Lx，机械通风+自然通风，室温15～20℃，湿度40%～60%。每天喂料三次（7:30、13:30、18:30），喂料量以每天基本不剩料为标准；并记录这三个时间点舍内温湿度。每日10:00、16:30两次捡蛋，捡蛋后分别进行记数、标记、存放。定期清理粪便，按照常规免疫程序进行免疫接种。整个试验期间自由采食和饮水。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生产性能

记录蛋重、产蛋个数、投料量、剩余料量、存栏鸡数，计算平均蛋重、产蛋率（包括破损蛋）、平均日采食量、料蛋比（包括破损蛋）。每星期结算一次采食量。蛋重（g）：用电子天平称量蛋重，精确到0.01 g。

平均产蛋率(%)=总产蛋数/(天数×鸡数)×100

平均蛋重(g)=总蛋重/蛋数

料蛋比=耗料量/蛋重

1.4.2 蛋品质

1.4.2.1 蛋形指数

用游标卡尺测量蛋的纵径与最大横径，精确到0.01 mm。

蛋形指数=纵径/横径

1.4.2.2 蛋壳相对重

蛋壳相对重(%)=蛋壳重/蛋重×100

1.4.2.3 含水量

将蛋清和蛋黄分离，分别称重，放入恒温干燥箱中50～53℃过夜，称重。

1.4.2.4 蛋清、蛋黄中蛋白质含量测定

将鸡蛋打开完全分离蛋清液和蛋黄液，用微量移液器吸取分离后的液体至称重过的消化管中，再次称消化管的重量，用FOSS消化炉消化，用FOSS凯氏定氮仪定氮。

1.4.3 肠道通透性

于试验期8周断料12 h，断水2 h后，从各处理每重复中随机选取1只进行翅静脉采血，3 500 r/min，4℃离心15 min，分离血清，迅速置于液氮内，分装，保存于-20℃冰箱，待测。

血清中的D-乳酸和二胺氧化酶用试剂盒（南京建成生物有限公司）检测。D-乳酸采用终点显色法检测，二胺氧化酶采用速率法检测。

1.4.4 紧密连接蛋白

取空肠中段，纵向剪开，用无菌玻片刮取黏膜，装入经DEPC处理过的EP管中，经液氮预冻后，保存于-80℃冰箱内，用于测定闭锁蛋白（occludin）和闭锁小带蛋白1（zonulaoccludins-1，ZO-1）的mRNA相对表达量。

采用TRIzol试剂（Invitrogen Life Technologies）提取空肠组织中的总RNA。RNA的浓度和纯度用分光光度计（NanoDrop 2000）进行测定，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。采用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]，将1 μg总RNA反转录成cDNA，保存于-20℃备用。采用qPCR方法测定occludin和ZO-1的基因表达。PCR引物序列见表2，由宝生物工程（大连）有限公司合成。qPCR的操作参照SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）[宝生物工程（大连）有限公司]的说明。qPCR在7500荧光定量仪（Applied Biosystems）上操作，PCR条件设置为95℃变性30 s，接着进行40个循环，每个循环由95℃变性5 s与60℃退火和延伸34 s构成。以β-actin为内参基因，用2-ΔΔCT方法计算相对基因表达量。

表2 目的基因和内参基因引物序列

1.5 统计分析

数据以“平均值±标准误”表示，采用SPSS 16.0进行方差分析，以Duncan′s法做多重比较，以Curve Estimation做非线性回归分析，以Pearson相关性分析对检测指标进行显著性分析，以P＜0.05为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 微生态制剂对蛋鸡生产性能的影响（见表3）

表3 微生态制剂对蛋鸡生产性能的影响

从表3中可以看出，与处理1相比，处理2、3、4蛋鸡平均产蛋率分别提高了0.56%（P＞0.05）、1.67%（P＜0.05）和1.66%（P＜0.05），平均蛋重分别提高了0.27%、1.44%和1.46%，差异不显著，与处理1相相比，处理3、4料蛋比均分别降低了0.54%（P＞0.05），差异不显著。

经统计分析表明，平均产蛋率和平均蛋重与微生态制剂的水平呈现出一定的相关性，因此分别以平均产蛋率和平均蛋重为因变量（y），以添加微生态制剂水平为自变量（x），获得相关回归方程。

平均产蛋率与添加微生态制剂水平呈现出二次项方程：y=-0.000 2x2+0.040 2x+89.739（R2=0.933 2，N=6）；平均蛋重与添加微生态制剂水平呈现出二次项方程：y=-0.000 1x2+0.021 4x+59.534（R2=0.874，N=6）。

2.2 微生态制剂对蛋鸡蛋品质的影响

2.2.1 微生态制剂对蛋形指数、蛋壳相对重、蛋清含水量、蛋黄含水量的影响（见表4）

表4 微生态制剂对蛋形指数、蛋壳相对重、蛋清含水量、蛋黄含水量的影响

从表4中可以看出，各处理组间蛋形指数无差异。与处理1相比，处理2、3和处理4蛋壳相对重均有提高趋势，以处理3最高，比处理1提高4.33%，但差异不显著（P＞0.05）。与处理1相比，处理2、3和处理4蛋清含水量分别降低1.97%（P＞0.05）、2.34%（P＜0.05）、2.41%（P＜0.05）。与处理1相比，处理2、3和处理4蛋黄含水量分别降低2.36%（P＞0.05）、5.27%（P＜0.05）、5.56%（P＜0.05）。

经统计分析表明，蛋壳相对重、蛋清含水量和蛋黄含水量与微生态制剂的水平呈现出一定的相关性，因此分别以蛋壳相对重、蛋清含水量和蛋黄含水量为因变量（y）,以添加微生态制剂水平为自变量（x）获得相关回归方程。

蛋壳相对重与添加微生态制剂水平呈现出二次项方程：y=-0.000 1x2+0.012 8x+8.963 2（R2=0.760 7，N=6）；蛋清含水量与添加微生态制剂水平呈现出二次项方程：y=0.000 5x2-0.065 6x+86.636（R2=0.960 3，N=6）；蛋黄含水量与添加微生态制剂水平呈现出二次项方程：y=0.000 4x2-0.073 1x+50.61（R2=0.977 5，N=6）。

2.2.2 微生态制剂对蛋清中蛋白质含量、蛋黄中蛋白质含量的影响（见表5）

表5 微生态制剂对蛋清中蛋白质含量、蛋黄中蛋白质含量的影响(%)

从表5中可以看出，与处理1相比，处理2、3和处理4蛋清中蛋白质含量分别提高4.72%（P＞0.05）、8.99%（P＜0.05）、8.45%（P＜0.05）。与处理1相比，处理2、3和处理4蛋黄中蛋白质含量分别提高0.87%（P＞0.05）、4.45%（P＜0.05）、3.52%（P＞0.05）。

经统计分析表明，蛋清中蛋白质含量和蛋黄中蛋白质含量与微生态制剂的水平呈现出一定的相关性，因此分别以蛋清中蛋白质含量和蛋黄中蛋白质含量为因变量（y）,以添加微生态制剂水平为自变量（x）获得相关回归方程。

蛋清中蛋白质含量与添加微生态制剂水平呈现出二次项方程：y=-0.000 2x2+0.029 1x+10.984（R2=0.988 5，N=6）；蛋黄中蛋白质含量与添加微生态制剂水平呈现出二次项方程：y=-0.000 1x2+0.019 1x+16.112（R2=0.816 4，N=6）。

2.3 微生态制剂对蛋鸡血清D-乳酸和二胺氧化酶的影响（见表6）

表6 微生态制剂对血清D-乳酸和二胺氧化酶的影响

从表6中可以看出，与处理1相比，处理2、3和处理4血清D-乳酸含量分别降低9.51（P＞0.05）、20.11（P＜0.05）和18.28（P＜0.05）。与处理1相比，处理2、3和处理4血清二胺氧化酶含量分别降低4.68（P＞0.05）、11.87（P＜0.05）和9.95（P＞0.05）。

经统计分析表明，D-乳酸和二胺氧化酶与微生态制剂的水平呈现出一定的相关性，因此分别以D-乳酸和二胺氧化酶为因变量（y）,以添加微生态制剂水平为自变量（x）获得相关回归方程。

D-乳酸与添加微生态制剂水平呈现出二次项方程：y=0.000 2x2-0.031 9x+5.507 1（R2=0.975 9，N=6）；二胺氧化酶与添加微生态制剂水平呈现出二次项方程：y=0.000 2x2-0.028 5x+8.393 7（R2=0.941 6，N=6）。

2.4 微生态制剂对蛋鸡空肠紧密连接相关蛋白mRNA相对表达水平的影响（见表7）

从表7中可以看出，与处理1相比，处理2、3和处理4空肠紧密连接蛋白occludin和ZO-1 mRNA相对表达水平显著提高（P＜0.05），且表达量随着添加梯度的增加而依次增加。

表7 微生态制剂对蛋鸡空肠紧密连接相关蛋白mRNA相对表达水平的影响

2.5 相关性分析

相关性分析指变量之间存在一定的客观规律，但数量上不是严格对应的依存关系（孙娟等，2016）。通过相关性分析可大体反映出指标之间相互颉颃或协同关系，若指标间存在显著或极显著正相关，则表明存在协同作用（翁城武等，2017）。

2.5.1 生产性能、蛋品质与血清D-乳酸和二胺氧化酶相关性分析（见表8）

表8 蛋品质与血清D-乳酸和二胺氧化酶相关性分析

从表8中可以看出，D-乳酸和二胺氧化酶与蛋黄含水量极呈显著和显著正相关。D-乳酸和二胺氧化酶分别与料蛋比和蛋清含水量存在正相关趋势。表明D-乳酸、二胺氧化酶与生产性能、蛋品质的交互作用以协同作用为主。

2.5.2 生产性能、蛋品质指标与紧密连接相关蛋白mRNA相对表达水平相关性分析（见表9）

表9 生产性能、蛋品质指标与紧密连接相关蛋白mRNA相对表达水平相关性分析

从表9中可以看出，occludin与产蛋率极显著正相关，与蛋重、蛋清中蛋白含量和蛋黄中蛋白含量显著正相关。ZO-1与产蛋率极显著正相关，与蛋重、蛋清中蛋白含量和蛋黄中蛋白含量显著正相关。表明紧密连接相关蛋白与生产性能、蛋品质的交互作用以协同作用为主。

3 讨论

D-乳酸和二胺氧化酶可作为胃肠黏膜受损程度和恢复状况的诊断指标（张妮等，2006；聂海等，2017）。D-乳酸是肠道固有细菌的代谢产物，哺乳动物不能产生、也没有代谢D-乳酸的酶。肠黏膜损害时，血液中D-乳酸浓度增加（Murray等，1994）。二胺氧化酶是一种小肠黏膜酶，能控制肠黏膜增殖，在血清中含量极低，肠黏膜细胞损伤后，进入血清中，可作为评价胃肠道黏膜损伤后黏膜细胞成熟和完整性的指标（苏璇等，2014；Thompson等，1987）。二胺氧化酶活性随着仔猪小肠黏膜损伤程度的加重而增加（胡泉舟等，2007）。鸡血液中D-乳酸含量随内毒素含量增加而增高，随内毒素含量减少而降低，而内毒素可导致肠黏膜通透性的增加（黄启亮等，2015）。益生菌可降低血清D-乳酸和二胺氧化酶水平，修复损伤肠黏膜，降低肠黏膜通透性，促进肠道屏障功能恢复（马丽滨等，2014；韩玉萍等，2017）。丁酸可改善肠道结构、刺激胰酶分泌，乙酸、丙酸可刺激肠道蠕动，改善肠道环境，而这三种短链脂肪酸是丁酸梭菌的代谢产物（Ho等，2011）。益生菌可降低患者D-乳酸和二胺氧化酶水平，降低患者肠道黏膜通透性，减轻了肠源性内毒素血症，促进肠道黏膜功能恢复（江巧丽等，2016；蒋欢等，2015）。与抗生素组和大肠杆菌攻毒组相比，丁酸梭菌可降低肉鸡血清二胺氧化酶的含量7.5%和17.75%，同时细菌易位的发生率也降低了，促进了肠道屏障功能的修复（周琳，2012）。本试验中，不同添加量微生态制剂可降低血清D-乳酸和血清二胺氧化酶水平，与上述报道一致。

跨膜蛋白和细胞质蛋白是肠上皮细胞的紧密连接的主要组成部分，闭锁蛋白（occludin）是一种跨膜蛋白，闭锁小带蛋白1（ZO-1）是常见的细胞质蛋白之一，occludin家族可与ZO-1共同构成紧密连接复合物；给予干预治疗，可上调炎症性肠病、腹泻等诱导的occludin和ZO-1表达下降，减小肠黏膜通透性，在一定程度上恢复肠道屏障功能，因此occludin和ZO-1通常作为评价机体紧密连接通透性和屏障功能的指标（王海燕等，2012；甘元涛等，2016；Visser等，2009）。冷应激通过降低occludin mRNA表达量增加雏鸡肠黏膜通透性，大豆抗原蛋白的主要致敏原β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白通过降低ZO-1 mRNA的相对表达量，损伤了肠道紧密连接（张雯，2010；曹程鸣等，2017）。益生菌提高了occludin表达，维持了肠上皮紧密连接，从而保护肠黏膜屏障、减少细菌易位（沈通一，2004）。益生菌可上调occludin和ZO-1蛋白的表达量，修复侵袭性大肠杆菌感染破坏的肠道完整性（张中伟等，2007）。益生菌可通过维持肠道菌群平衡，增加occludin的表达，改善肠道上皮的机械屏障，治疗结肠炎（张文远等，2010）。益生菌或者合生素（益生菌+纤维寡糖）可上调occludin和ZO-1蛋白表达量，改善热应激导致的肉鸡生产性能下降和肠道屏障功能受损（宋娟，2014）。在我们的研究中发现，不同梯度的微生态制剂可不同程度的提高occludin和ZO-1的表达量，说明微生态制剂对肠道屏障保护功能涉及到紧密连接。

肠道的屏障功能对动物机体至关重要，完整的、良好的肠黏膜可避免细菌、毒素和日粮抗原向黏膜下的组织或机体循环系统的渗透（马改彦等，2017）。益生菌可显著减低仔猪血清内毒素和D-乳酸含量，降低肠黏膜通透性，减少了腹泻率，保证了仔猪生产性能（庞敏，2016）。微生态制剂（如丁酸梭菌、屎肠球菌等）及其产物[维生素、酶（蛋白酶、纤维素酶）、短链脂肪酸等]可通过改善肠道屏障完整性的关键性调节因子——肠道共生菌平衡，提高畜禽肠道屏障功能，促进机体对饲料（如饲料代谢能、蛋白质等营养成分和微量元素钙、铁等）的消化利用率，显著提高动物生产性能和产品品质（邱权等，2016；Hugas等，2003；Tuomola等，1998；Hooper等，2001；张建云，2012）。李育苗（2017）认为微生态制剂及其产物可减少肠内蛋白向氨或胺的转化，增加其向鸡蛋中蛋白转化，从而提升蛋品质。丁酸梭菌上调肠上皮紧密连接相关蛋白mRNA相对表达水平，改善了断奶仔猪肠黏膜屏障功能，提高了仔猪的生长性能（李玉鹏等，2017）。益生菌显著降低了蛋鸡血清中D-乳酸和二胺氧化酶活性，显著增加了肠黏膜occludin和ZO-1 mRNA表达量，减少了内毒素对肠结构的破坏，从而改善了蛋鸡对饲料的消化利用，其生产性能得到提高（雷凯，2015）。由此可推测，微生态制剂通过改善肠道通透性和肠道紧密连接，提高了蛋白质等营养物质的消化吸收，从而提高了鸡蛋中营养成分含量和蛋鸡生产性能。