御唐丸对糖尿病大鼠胰岛β细胞中PDX-1mRNA及蛋白表达的影响

郑 南，谢 宁，张佩青，高丽娟

（1.黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨 150040； 2.黑龙江省中医药科学院，哈尔滨 150000；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）作为继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病，其发病机制尚未完全明确，临床患者多产生内分泌代谢障碍，以多饮、多食、多尿、消瘦以及慢性持续性血糖浓度升高为主要表现[1]。中医治疗DM历史悠久，对DM发病原因及发病机制具有自己独到见解[2]，运用中医学理论防治DM及其并发症也已成为治疗糖尿病的有效手段[3]。导师谢宁教授在大量动物实验和临床实践的基础上，结合历代名医治疗消渴病的宝贵经验和大量珍贵文献，拟定方剂御唐丸，前期大量实验证明该药能够有效改善2型糖尿病胰岛素抵抗。胰腺十二指肠同源盒-1（PDX-1）主要在胰岛细胞中表达，是至关重要的转录因子[4]。PDX-1mRNA表达不仅可维持胰岛β细胞功能，还可保证胰岛素的合成与分泌。御唐丸对T2DM的治疗作用，是否涉及到对于PDX-1的调控作用的影响，本实验基于此来进行研究。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料 SPF级健康雄性SD大鼠150只，8周龄，体质量（180±20）g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SYXK（黑）2017-012。御唐丸：主要成分由黄芪、白芍、玉竹、山茱萸、乌梅、龟板、鹿茸、女贞子、西洋参、山药、麦冬、葛根等组成，由黑龙江省中西医结合研究所制剂室生产。糖尿乐：0.31 g /片，郑州韩都药业集团有限公司生产，批准文号：国药准字Z20050771。格华止：0.85 g/片，中美上海施贵宝制药有限公司生产，批准文号：国药准字H20023371。链脲佐菌素（STZ）购于美国Sigma公司；游离脂肪酸测定试剂盒（NEFA）购于南京建成生物科技有限公司；苏木精-伊红生物染色剂购于上海谱振生物科技有限公司；PDX-1试剂及β-actin抗体购买于美国CST公司；Super-GL ECL 超敏发光液、蛋白裂解液购买于上海艾博思生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂购于美国Roche公司。

1.2 模型制备 将150只大鼠适应性饲养1周后，按照体质量分层随机分为空白组20只，造模组130只。空白组喂养基础饲料，造模组喂养高脂高糖饲料，连续喂养10周后，禁食水12 h，造模组给予1%STZ溶液30 mg/kg腹腔注射，空白组给予柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液2 mL腹腔注射。72 h后尾静脉取血测定大鼠空腹血糖，选取空腹血糖≥16.7 mmol/L，判定T2DM成模，实验成功复制模型大鼠102只。

1.3 分组及给药 随机选择100只成模大鼠分为模型对照组（模型组）、御唐丸高剂量组（中高组）、御唐丸低剂量组（中低组）、糖尿乐组（中对组）、格华止组（西对组），每组20只。未经造模处理的20只大鼠作为空白组，各组大鼠组内进行标记。按照大鼠与人等效剂量折算，中高组给予2.70 g/（kg·d）、中低组给予1.35 g/（kg·d）、中对组给予2.43 g/（kg·d）、西对组给予0.09 g/（kg·d）、模型组、空白组给予2 mL生理盐水。大鼠成模当天开始统一灌胃给药，连续给药8周后，实验动物全部处死、取样。

1.4 各指标检测方法

1.4.1 空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）及游离脂肪酸（Nonestesterified fatty acid，NEFA） 饲养期间，每两周周末大鼠禁食取血，采用血糖仪测定血糖。

饲养结束后釆用可见光分光光度计检测血清中游离脂肪酸，按规定操作。

1.4.2 组织病理学HE染色 石蜡切片脱蜡至水后苏木素（H）染液5 min，分化10 s，自来水冲洗使细胞核蓝化后，用蒸馏水清洗，入伊红（E）染液1 min后，脱水透明，最终树脂封片。

1.4.3 用RT-PCR方法检测PDX-1mRNA表达水平 设计PDX-1的引物序列，其上游引物为5'-ATCAAAATCTGGTTCCAAAACCGTC-3'，下游引物为5'-CTCGTTGTCCCGCTACTACGTTTC-3'，置于反应体系中进行40个变性退火延伸循环。

1.4.4 用Western Blot方法检测PDX-1蛋白水平 将组织细胞裂解后加热冷却离心，去除沉淀后分离，进行电泳，转移封闭，温育洗涤后，进行发光检测，曝光定影，最后分析处理蛋白表达水平。

1.5 统计学处理 数据统计学处理用SPSS 17.0软件完成。计量资料应用均数±标准差（）表示，多组间比较用方差分析，两两比较应用q检验。

2 结果

2.1 大鼠空腹血糖水平 从表1中可以看出：治疗前，与空白组相比，模型组血糖显著升高（P＜0.01），说明造模成功；治疗2周后，与模型组相比，西对组血糖显著降低（P＜0.01）；中低组、中高组血糖显著高于西对组（P＜0.01）。治疗4周后，与模型组相比，中低组、中高组、西对组血糖有所降低（P＜0.05或P＜0.01）。治疗6周后，与模型组相比，各治疗组血糖降低显著（P＜0.01）。治疗8周后，中低组、中高组血糖低于中对组（P＜0.05或P＜0.01），中低组血糖显著高于西对组（P＜0.01）。

2.2 大鼠游离脂肪酸水平 见表2。给药8周后，大鼠NEFA水平下降明显：与空白组相比，模型组NEFA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，中低组、中高组、西对组NEFA水平均降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 HE染色光镜下观察胰腺组织 空白组胰岛细胞形态饱满、轮廓清晰、结构规整（图1）；模型组胰岛细胞形态萎缩、体积缩小、数目减少，部分出现空泡变形情况（图2）；中高组胰岛细胞少有萎缩，胞浆内的空泡样变性也较少（图3）；中低组胰岛细胞大量出现空泡变性，大小不等，毛细血管内壁增厚（图4）；西对组胰岛细胞少量出现空泡变性，体积如常，毛细血管扩张充血不明显（图5）；中对组胰岛局部区域有明显的毛细血管扩张充血，胰岛细胞有大小不等的空泡变性（图6）。

2.4 对大鼠PDX-1mRNA表达的影响 见表2。与空白组相比，模型组PDX-1mRNA的相对表达量显著减少（P＜0.01）；与模型组相比，各治疗组PDX-1mRNA的相对表达量均有所增加（P＜0.05或 P＜0.01）。

2.5 对大鼠PDX-1蛋白表达的影响 从表2、图7可以看出：与空白组相比，模型组大鼠胰腺组织中PDX-1蛋白表达量显著下降（P＜0.01）；与模型组相比，各治疗组大鼠胰腺组织中PDX-1蛋白表达水平均有所升高，其中中低组、中高组、西对组差异显著（P＜0.01），中对组有差异（P＜0.05）；与中对组相比，中高组、西对组、中低组PDX-1蛋白表达量有所升高（P＜0.01或P＜0.05）；中高组PDX-1蛋白表达量高于中低组（P＜0.05）。

表1 给药前至给药8周各组大鼠血糖变化（ ）

注：与空白组比较，# P＜0.05，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中对组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与西对组比较，■P＜0.05，■■P＜0.01

组 别 n 0周 2周 4周 6周 8周空白组 8 5.79±0.94 5.83±0.85 6.06±0.91 5.72±0.86 5.78±0.89模型组 8 24.78±2.05## 24.36±2.61## 23.83±2.02## 23.23±2.56## 22.61±2.73##中低组 8 24.29±1.74## 24.34±2.10##■■ 21.00±2.58##△■■ 19.11±1.91##△△■■ 15.35±2.22##△△▲■■中高组 8 24.58±1.72## 23.36±2.39##■■ 19.01±2.00##△△▲ 17.46±1.89##△△ 13.35±2.00##△△▲▲中对组 8 25.89±2.30## 24.24±3.12## 21.72±2.02## 19.13±2.37##△△ 17.50±2.29##△△西对组 8 24.85±1.26## 19.23±1.88##△△ 17.08±2.61##△△ 15.85±2.20##△△ 11.83±1.91##△△

表2 各组大鼠NEFA水平、胰腺组织PDX-1mRNA、PDX-1蛋白表达水平（ ）

表2 各组大鼠NEFA水平、胰腺组织PDX-1mRNA、PDX-1蛋白表达水平（ ）

注：与空白组比较，# P＜0.05，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中对组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与西对组比较，■P＜0.05，■■P＜0.01；与中低组比较，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01

组 别 n 空白组 模型组 中低组 中高组 中对组 西对组NEFA（μmol/L） 8 0.89±0.18 1.50±0.32## 1.25±0.28##△ 1.16±0.15#△△ 1.30±0.24## 1.14±0.14#△△PDX-1 mRNAA 5 1.64±0.11 0.97±0.14## 1.19±0.12##△■ 1.39±0.15##△△▲◆ 1.18±0.11##△ 1.43±0.16#△△▲▲PDX-1 5 1.437±0.212 0.327±0.039## 0.692±0.073##△△▲ 0.865±0.108##△△▲▲◆ 0.531±0.078##△ 0.757±0.097##△△▲▲

图1 空白组

图2 模型组

图3 御唐丸高剂量组

图4 御唐丸低剂量组

图5 格华止组

图6 糖尿乐组

图7 对大鼠PDX-1蛋白表达的影响

3 讨论

葡萄糖能够对胰岛素的基因表达及内分泌系统胰岛β细胞合成并分泌胰岛素产生诱导，但若血糖浓度长时间维持在较高的状态，反而会对其产生抑制。这种状况也同样发生于游离脂肪酸（FFA）对血糖浓度的调节中，血浆中FFA的浓度长时间维持在较高状态，反而会对胰岛素的基因表达及内分泌系统胰岛β细胞合成并分泌胰岛素产生抑制，上述两种抑制作用分别被称为“高糖毒性”和“高脂毒性”[5]。

血糖浓度增高的主要原因是机体内胰岛β细胞合成并分泌胰岛素或是胰岛素在机体内被利用的过程发生障碍[6]。胰腺十二指肠同源盒-1（PDX-1）主要在胰岛细胞中表达，是至关重要的转录因子，包含同源的胰岛素DNA启动子结构域。PDX-1具有对胰岛细胞的凋亡产生抑制、对胰岛细胞定向分化产生促进作用的功能[7]。PDX-1对胰岛β细胞中含有的特异基因表达、胰岛细胞分化增殖和胰腺发育均具有调节作用。此外，PDX-1对胰淀素、葡萄糖激酶、葡萄糖转运蛋白2等在胰岛素分泌过程中与之相关的基因表达亦具有调节作用[8]。相关研究也表明，体内氧化应激反应可以通过激活JNK，参与调节PDX-1核/质易位，抑制PDX-1mRNA表达，导致DNA和PDX-1相结合的能力明显降低，从而阻碍胰岛素基因进行表达。因此，PDX-1mRNA表达正常不仅对胰岛β细胞正常功能的维持具有重大意义，还可保证胰岛素的合成与分泌正常进行。

糖尿病患者体内长期处于“高糖毒性”和“高脂毒性”环境，其血浆中葡萄糖FFA的浓度长时间维持在较高的状态，且机体消除能力不足，导致机体新陈代谢生成大量RNS及ROS，可以对脂质、蛋白质甚至是DNA直接进行氧化破坏，产生氧化应激反应。实验表明[9]，JNK通路与T2DM的发病及胰岛素抵抗关系密切，JNK信号通路被激活后能够对细胞内的DNA与PDX-1相结合的能力进行调节[10]。

中医药治疗DM的作用机制具有多层面、多方向及多靶点等显著特点，能够有效降低和延缓DM及其并发症的发生[11-13]。本实验通过对JNK信号通路相关因子的研究，证实了御唐丸能够促进精微物质在体内的消化吸收，增强体内胰岛素的靶细胞、靶组织对胰岛素的敏感性，能够在减少血糖的来源的同时增加血糖的去路，从而降低血糖浓度，有效改善T2DM大鼠糖脂代谢，还可上调PDX-1mRNA的表达，促进PDX-1蛋白表达，进一步说明了御唐丸能够通过调控JNK信号通路改善胰岛素抵抗,对胰岛组织进行修复，进而使血糖浓度降低[14-15]。