新疆伊犁地区捻转血矛线虫种群I型β微管蛋白基因苯并咪唑抗药性相关单核苷酸多态性调查

杨 新,雷卫强,邸文达,王春群,周彩显,张宗泽,方 瑞,周艳琴,赵俊龙,胡 敏

（华中农业大学动物医学院 农业微生物学国家重点实验室,湖北 武汉 430070）

捻转血矛线虫是一种重要的小反刍动物寄生线虫,呈世界性分布,致病性强。该线虫可以感染多种反刍动物,尤其是绵羊和山羊,主要寄生于动物的真胃内,引起血矛线虫病导致巨大的经济损失[1]。由于没有疫苗可用,捻转血矛线虫的防控主要依赖于化学药物的使用,常用的化学药物包括苯并咪唑类、大环内酯类及烟碱激动剂类[2]。由于长期以及不合理的使用这些化学药物,近些年,国内外关于捻转血矛线虫抗药性的报道越来越普遍[3-5]。苯并咪唑类药物是使用时间最长的一类药物,其抗药性的产生是由捻转血矛线虫 I型β微管蛋白编码基因的3个单核苷酸多态性（SNP）造成的,分别是167位点由苯丙氨酸变为络氨酸（TT CTAC）[6],198位点由谷氨酸变为丙氨酸 （GAAGCA）[7],200位点由苯丙氨酸变为络氨酸（TTCTAC）[8]。2017年7月,新疆伊犁地区某羊场疑似暴发捻转血矛线虫病,短时间造成数头绵羊的死亡,通过剖检,在死亡羊的真胃内发现大量红色头发丝状的捻转血矛线虫。为了解该羊场捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗药性情况,以便于后续捻转血矛线虫病的有效防控,故在该场开展了捻转血矛线虫种群I型β微管蛋白基因苯并咪唑抗药性相关单核苷酸多态性的调查研究。

1 材料与方法

1.1 样品采集 从新疆伊犁地区某羊场死亡的绵羊真胃中采集了捻转血矛线虫成虫样品,用生理盐水充分清洗后,雌雄分开保存于70%酒精中,-20℃保存备用。

1.2 引物设计 参照Bott[9]和von Samson-Himmelstjerna[10]的方法,分别合成针对捻转血矛线虫核糖体第二内转录间隔（ITS-2）序列和I型β微管蛋白（β-tubulin）编码基因序列的特异性引物（表1）,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,扩增片段分别为 265 bp（ITS-2）和385 bp（β-tubulin）。

1.3 主要试剂及仪器 乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸钠（SDS）,及三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）,购自上海国药集团;蛋白酶K,购自赛默飞世尔科技有限公司;Wizard®DNA Clean-Up System基因组DNA纯化试剂盒,购自Promega公司;10X PCR Buffer、dNTP、rTaq DNA 聚合酶等 PCR扩增用试剂,购自宝生物工程（大连）有限公司;Trans 2K Plus I DNA Marker、10 × DNA Loading Buffer,购自北京全式金生物技术有限公司;琼脂糖、溴化乙锭,购自Sigma-Aldrich公司;PCR仪,购自北京东胜创新生物科技有限公司。

1.4 基因组DNA的提取 按照Gasser的方法分别提取了27条捻转血矛线虫雄虫的基因组DNA[11],然后使用Wizard DNA Clean-Up System对提取的基因组DNA进行纯化。

1.5 虫体ITS-2序列的PCR扩增鉴定 反应体系:10X PCR Buffer 2.5 μL,dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL,上游引物（ITS-2-F;10 mmol/L）1.0 μL,下游引物（ITS-2-R;10 mmol/L）1.0 μL,Taq 酶（5 U/μL）0.3 μL,基因组 DNA 2.0 μL,加 ddH2O 至 25 μL。扩增条件:94℃预变性5 min,然后94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s,共35个循环,最后72℃延伸7 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后,经紫外透射仪观察结果。

1.6 I型β微管蛋白基因的PCR扩增 反应体系:10X PCR Buffer 2.5 μL,dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL,上游引物（β-tubulin-F;10 mmol/L）1.0 μL,下游引物（β-tubulin-R;10 mmol/L）1.0 μL,Taq 酶（5 U/μL）0.3 μL,基因组 DNA 2.0 μL,加 ddH2O 至25 μL。扩增条件:94℃预变性5 min,然后94℃变性40 s、53℃退火40 s、68℃延伸40 s,共40个循环,最后68℃延伸7 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后,经紫外透射仪观察结果。

1.7 数据分析 将27条捻转血矛线虫雄虫的I型β微管蛋白基因PCR扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序,测序后对序列信息进行分析,统计该捻转血矛线虫种群苯并咪唑类药物抗药性相关单核苷酸多态性情况。

2 结果

2.1 捻转血矛线虫ITS-2序列PCR扩增鉴定 使用捻转血矛线虫ITS-2种特异性引物对提取的27条雄虫样品进行PCR扩增,通过电泳鉴定,均出现大小为265 bp的特异性目的条带,说明这27条雄虫样品均为捻转血矛线虫（见图1）,可用于后续试验。

图1 ITS-2基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

2.2 捻转血矛线虫I型β微管蛋白基因的PCR扩增 使用捻转血矛线虫I型β微管蛋白基因特异性引物对27条捻转血矛线虫雄虫样品进行PCR扩增后,通过电泳鉴定,均出现大小为385 bp的特异性目的条带（见图2）,说明成功扩增到I型β微管蛋白基因。对这27条捻转血矛线虫I型β微管蛋白基因PCR扩增产物进行测序,用于后续的单核苷酸多态性（SNP）分析。

图2 I型β微管蛋白基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

2.3 捻转血矛线虫苯并咪唑类抗药性相关SNP的检测 对27条捻转血矛线虫雄虫样品I型β微管蛋白基因序列的3个苯并咪唑类药物抗药性相关单核苷酸多态性进行分析后,发现这27条捻转血矛线虫雄虫在167位点均为纯合敏感型,没有抗药型存在;在198位点,22条虫体（81.48%）为纯合敏感型,3条虫体（11.11%）为杂合抗药型,2条虫体（7.41%）为纯合抗药型;在200位点,25条虫体（92.59%）为纯合敏感型,2条虫体（7.41%）为杂合抗药型（见表2）。在这27条捻转血矛线虫雄虫样品I型β微管蛋白基因序列中共发现4种基因型（见中插彩版图3）,分别是198纯合敏感型及200位点纯合敏感型（20;74.07%）、198杂合抗药型及200位点纯合敏感型（3;11.11%）、198纯合敏感型及200位点杂合抗药型（2;7.41%）和198纯合抗药型及200位点纯合敏感型（2;7.41%）（见表3）。

表2 新疆伊犁地区捻转血矛线虫种群I型β微管蛋白167,198位点和200位点的单核苷酸多态性

表3 新疆伊犁地区捻转血矛线虫种群I型β微管蛋白的基因型及其频率

3 分析与讨论

本试验首次调查了新疆伊犁地区捻转血矛线虫种群苯并咪唑类药物抗药性相关基因I型β微管蛋白基因序列的3个单核苷酸多态性位点（F167Y,E198A和F200Y）。结果表明,仅在198位点和200位点发现,抗药性突变,且198位点抗药性突变的频率比200位点要高,没有在167位点发现抗药性突变,这与我国黑龙江、辽宁、内蒙古、河北、陕西、云南、广西及湖北地区调查的结果一致[12],但在其他国家发现了167位点的抗药性突变[13]。之前,薄新文等通过多重PCR检测了我国不同地区捻转血矛线虫I型β微管蛋白基因200位点的突变情况,结果发现,新疆地区的捻转血矛线虫表现为敏感型,未发现抗药型,而本文研究发现新疆地区已经出现纯合抗药型突变[14]。Barrere等报道,若一个种群中,有超过10%的个体携带抗药基因型（包括一个位点出现纯合抗药型突变和两个位点同时出现杂合抗药型突变）,则认为这个种群存在抗药性,不过该学者在调查过程中只发现167位点和200位点的抗药型突变,并没有198位点的抗药型突变[15]。本研究中,新疆伊犁地区捻转血矛线虫种群198位点和200位点的抗药基因型频率为7.4%,虽然没有超过10%,但是存在198位点的纯合抗药基因型,说明该地区还是存在苯并咪唑抗药性的风险,需要引起我们的警惕,后续需要采取措施来进行控制。

除了分子生物学的方法,粪便虫卵计数减少实验（FECRT）和虫卵孵化实验（EHA）也被用在我国苯并咪唑类药物抗药性的调查。到目前为止,我国的部分省份开展了苯并咪唑类药物抗药性的调查,从调查的结果来看,我国江苏、黑龙江、上海、宁夏、新疆等省份苯并咪唑类药物抗药性还是普遍存在的[4-5,16-19]。苯并咪唑类药物在我国已经使用了数十年,据报道,一种新药物一般使用10年左右就可能产生抗药性[20],未来,我们需要在更多的省份和地区开展苯并咪唑类药物抗药性的调查,全面的了解我国苯并咪唑类药物抗药性现状,以便及时采取措施进行控制。

在山羊和绵羊养殖业迅猛发展的今天,寄生虫病仍然是制约养殖业发展的重要因素,由于长期使用化学药物来进行寄生虫病的防控,抗药性问题越来越普遍和严重。本研究首次报道了新疆伊犁地区绵羊体内捻转血矛线虫种群苯并咪唑类药物抗药型基因突变的存在,需要引起该场及周边养殖户们的重视,采取相关饲养管理措施来减缓抗药性的产生和发展,避免造成巨大的经济损失。