不同产地普洱生茶中总游离氨基酸含量的区别研究

王石磊，雷文波，余佳慧，饶桂维

(1.浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310015;2.丽水海关检验检疫综合技术服务中心，浙江丽水 323000)

普洱茶是一种深受广大消费者喜爱的云南特色茶叶品种，它以云南大叶种晒青毛茶为原料，采用特定的加工工艺制成，具有其独特的品质［1］。广义的“普洱茶”包括普洱生茶，普洱陈茶和普洱熟茶三大类。普洱生茶是指未经发酵生产的晒青毛茶，既可作为绿茶直接饮用，又可通过自然发酵转化为普洱陈茶，或通过人工发酵技术快速转化为普洱熟茶［2］。现代科学研究证实普洱茶具有多种保健功效，尤其是降脂减肥方面效果的报道较多［3］。普洱茶含有黄酮、茶多酚、儿茶素、生物碱、氨基酸、茶色素、有机酸、游离糖、游离氨基酸等大量化学成分［3］。氨基酸作为普洱茶的主要成分之一，对普洱茶品质和内含物质的转化都有着重要的影响［4］。游离氨基酸是普洱茶品质的重要评判指标之一，茶叶鲜爽与否与其含量密切相关，其参与的化学反应与普洱茶叶香气物质的形成密切相关［5］。晒青茶作为制作普洱茶的基础原料，其品质受季节、树龄、产地等因素影响［6］，为此不同产地出产的普洱生茶中游离氨基酸等物质的含量也存在一定的差异。本文先通过单因素与正交实验优化了普洱生茶中总游离氨基酸的提取方法，再在最佳提取条件下对澜沧市、德宏州、西双版纳等6个不同产地的普洱生茶含有的游离氨基酸总量进行了测定。

1 材料与仪器

不同产地的普洱生茶(市售)，磷酸氢二钠(AR)，磷酸二氢钾(AR)，茚三酮(含量≥99%)，谷氨酸(含量≥99%)，比色管(具塞)，容量瓶，电子分析天平，可见分光光度计(日本岛津UV－124型)。

2 实验方法

2.1 标准曲线的建立

虽然游离氨基酸测定的国标中规定茶氨酸和谷氨酸均可作为茶叶中游离氨基酸测定的标准物质［7］，但考虑到灵敏度等问题［3］，本实验选取谷氨酸作为标准品来绘制标准曲线。先配制浓度为10 mg/mL的谷氨酸标准储备液，称取250 mg谷氨酸溶于适量水中，转移定容至25 mL，摇匀。该标准储备液1 mL含有 10 mg 的谷氨酸。从中准确吸取 0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别加水定容至50mL，摇匀。该系列标准工作液1 mL分别含有 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg 谷氨酸。

分别吸取1 mL谷氨酸系列标准工作液于一组25 mL比色管中，各加pH值8.0磷酸盐缓冲液0.5 mL和2%茚三酮溶液0.5 mL，在沸水浴中加热15min。待冷却后加水定容至25 mL。放置10min后，以试剂空白溶液作参比，用紫外可见分光光度计测定样品在570 nm处的吸光度A。将测得的吸光度与对应的谷氨酸浓度的绘制标准曲线，计算回归方程。

2.2 不同产地普洱茶中干物质含量的测定

准确称取普洱生茶试样2 g(精确至0.0001 g)于已知质量的玻璃扁形称量瓶中，置于103℃士2℃烘箱内(瓶盖斜支于瓶边)。干燥4 h后，加盖取出，置干燥器内冷却至室温，称量(精确至0.0001 g)。再置于烘箱中干燥1 h，加盖取出，于干燥器内冷却，称量(精确至0.0001 g)。重复干燥1h的操作，直至恒重(连续两次称重差不超过0.005 g)，以最小质量记为烘干后的质量。计算茶叶水分含量及干物质含量，以质量分数(%)表示，水分含量按下式进行计算:

式中:

m1:试样和烘皿烘前的质量，单位为克(g);

m2:试样和烘皿烘后的质量，单位为克(g);

m0:试样的质量，单位为克(g)。

2.3 普洱生茶中总游离氨基酸的提取工艺优化

2.3.1 提取温度的确定

选取提取时间为40min，用蒸馏水浸提，料液比为1∶100，分别在20、40、60、80、100℃的提取温度下提取茶叶中游离氨基酸，测定游离氨基酸得率与提取温度之间的关系。

2.3.2 提取时间的确定

取提取温度100℃，料液比为1∶100，用蒸馏水浸提，分别提取 10、20、30、40、50、60min 浸，研究游离氨基酸得率与提取时间的关系。

2.3.3 料液比的确定

选取提取温度为100℃，提取时间为40min，用蒸馏水浸提，分别在 1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180 的料液比下浸提游离氨基酸，研究游离氨基酸得率和液料比之间的关系。

2.3.4 正交实验

在单因素研究的基础上，以浸提温度、浸提时间、料液比3个因素为自变量，3因素3水平建立正交试验表，根据单因素的结果设计正交试验并进行实验。

2.4 不同产地普洱茶中总游离氨基酸含量的测定

分别精确称取六个不同产地的普洱茶样品2 g(精确至0.0001 g)，选取正交实验中确定的最优条件进行游离氨基酸的提取，分别进行三次平行试验，测试结果取平均值，比较各地普洱茶中的总游离氨基酸的含量区别。

3 结果和分析

3.1 谷氨酸的标准曲线

将测得的吸光度对谷氨酸溶液的浓度进行线性回归分析，得出回归方程为 y=2.9971x －0.082，R2=0.9939，表明谷氨酸溶液在0～0.6 mg/L之间与吸光度线性关系良好，实验结果见图1。

图1 谷氨酸浓度与吸光度之间的关系Fig.1 Relationship between the concentration of glutamic acid and the absorbance

3.2 不同产地普洱茶中干物质含量

按2.2中的方法测得不同产地普洱茶中的水分含量和干物质含量，结果如表1所示。

表1 不同产地普洱茶中干物质含量Table1 Dry matter content in pu＇er tea from different areas

3.3 普洱生茶中总游离氨基酸的提取工艺优化

3.3.1 提取温度对游离氨基酸得率的影响

选取提取时间为40min，用蒸馏水浸提，料液比为1∶100，分别在20、40、60、80、100℃的提取温度下提取普洱茶中游离氨基酸，测得游离氨基酸含量与提取温度之间的关系，实验结果见图2。

图2 温度对浸提游离氨基酸的影响Fig.2 The influence of temperature on the extraction of free amino acids

如图2可见，随着温度的升高，游离氨基酸的得率增加显著。由于浸提溶液为蒸馏水，蒸馏水的沸点为100℃，为此只能测得在最高实验温度100℃时，游离氨基酸得率最高。

3.3.2 提取时间对游离氨基酸得率的影响

取提取温度100℃，用蒸馏水浸提，料液比为1∶100，分别提取时间 10、20、30、40、50、60min，研究游离氨基酸含量与得率之间的关系，实验结果见图3。

图3 提取时间对茶叶中游离氨基酸得率的影响Fig.3 The influence of time on the extraction of free amino acids

试验表明，提取时间在40min时，提得的游离氨基酸得率最高，达到了1.99%。继续延长提取时间，游离氨基酸含量反而下降。因此提取40min为浸提时间的最佳选择。

3.3.3 料液比对游离氨基酸得率的影响

选取提取温度为100℃，提取时间为40min，用蒸馏水浸提，分别在 1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180 的料液比下浸提游离氨基酸，研究游离氨基酸得率与液料比之间的关系，实验结果见图4。

图4 提取液料比与游离氨基酸得率之间的关系Fig.4 The influence of solid － liquid ratio on the extraction of free amino acids

由图4可知当液料比低于100∶1时，随液料比的增加，氨基酸的得率增加，但液料比高于100∶1时，随着液料比的增加，游离氨基酸的得率反而略有下降，液料比100∶1相对是一个较优的提取条件。

3.3.4 正交实验

为了进一步优化提取方案，在单因素试验的基础上，选择提取温度、提取时间、料液比3个对游离氨基酸得率影响较大的因素，设计了3因素3水平的正交实验，试验因素水平见表2，正交试验结果，见表3。

表2 正交试验设计Table2 Factor level of experiment

表3 正交试验设计表及结果Table3 Orthogonal experiment chart and result

从表3可知，提取温度、提取时间和料液比都是普洱茶中游离氨基酸提取的重要影响因素。其中由R值可知，浸提时间是影响普洱茶中游离氨基酸提取得率最大的因素，其次是料液比，最后是提取温度。根据正交实验所得出的最佳工艺条件为提取温度:100℃，提取时间:40min，料液比1∶100。为了验证实验结果的可靠性，按照正交实验得到的最佳工艺条件对德宏州产的普洱生茶平行提取三次，求得游离氨基酸的得率平均值为2.05%，实验结果具有较好的重现性。

3.4 不同产地普洱茶中游离氨基酸含量的测定

以正交实验得出的最佳提取条件，对六个不同地区的普洱生茶中的总游离氨基酸含量进行测定，测定结果见表4。由实验结果可知，临沧地区的普洱生茶中游离氨基酸的含量相对较高。

表4 不同产地普洱茶中游离氨基酸的含量Table4 Free amino acids content in pu＇er tea from different areas

4 结论

(1)以谷氨酸作为标准物质，在浓度0～0.6 mg/L范围内与茚三酮反应的产物在570nm波长下与吸光度的线性关系良好。

(2)以蒸馏水作为溶剂，在加热情况下提取普洱生茶中的游离氨基酸，随着提取温度的升高，游离氨基酸的得率不断提高，在最高提取温度100℃下有最高的提取率;随着提取时间的增加，提取得到的游离氨基酸得率先升高再降低，在提取40min后得率最高;随着液料比的增加，提取得率先升后降，在液料比100∶1的情况下有最高的提取得率。正交实验表明，提取条件中提取时间是影响最大的因素，其次是液料比，最后才是提取温度。根据正交实验所得出的最佳工艺条件为提取温度:100℃，提取时间:40min，料液比 1∶100。

(3)利用单因素和正交实验得出的最优提取条件对6个不同产地的普洱生茶进行游离氨基酸含量的测定，不同产地的普洱生茶游离氨基酸含量存在一定的差别，但是差别不算太大，其中临沧市出产的普洱茶中游离氨基酸含量最高，达到了2.38%。