新型食用菌料酒的制备以及功能性成分的研究

李茜云，马鹏程，郭 明 ，，李博斌，胡芳玉

(1.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江杭州311300； 2.浙江农林大学理学院，浙江杭州311300； 3.绍兴市质量技术监督检测院，浙江绍兴312071）

当前市面上的料酒主要分为勾兑料酒和酿造料酒，其中勾兑料酒主要是以食用酒精为主体，添加配料而成；而原酿料酒则采用陈年原酿黄酒为主体配制而得，酿造料酒质量明显优于勾兑料酒[1]，但是原酿料酒在其保健营养和提鲜的功能上尚有提升的空间，故开发功能性料酒产品十分有必要。

现在研发的功能性料酒多是利用功能产品提取物进行深加工，利用共同后发酵的工艺尚少。在料酒发酵过程中，主酵及后酵前期主要进行的是酒精的积累，包括淀粉糖化和酒精发酵；后酵则主要进行料酒风味物质的沉积，这其中就包括肽和氨基酸等含氮物质的生成以及酯类等风味物质的合成。食用菌中含有丰富的氨基酸、核苷酸和多糖等营养物质和呈香呈味物质，因此，将食用菌添加到料酒的后发酵中共同酿造，能够在保证料酒酒精度的情况下，使食用菌料酒独特的色香味得到融合，料酒在发酵阶段即可形成食用菌料酒主体滋味和香气，发酵型的功能性料酒有较好的口感，在保留食用菌本身营养成分的同时，增强料酒的益生功能，使料酒的风格多样化，并且发酵型的料酒促进了酒体的稳定性，同提取液勾兑的料酒相比，避免了沉淀的产生，具有良好的储藏稳定性。开展此食用菌功能料酒的研究是极有新意的研究。

食用菌和原酿料酒中均含有丰富的氨基酸、多糖、多酚、核苷酸、蛋白质和萜类物质等非挥发性成分，该领域研究已成为热点。张莹等[2]对金针菇和茶树菇中影响其滋味的非挥发性成分氨基酸和核苷酸进行分析研究，其中天冬氨酸、谷氨酸、5'-鸟苷酸和5'-肌苷酸等为代表的滋味成分；Bai等[3-4]研究发现，食用菌的抗氧化作用与多糖和多酚的含量密切相关；张颖等[5]研究发现，5种不同的食用菌多糖具有不同程度的抗氧化作用；潘孙雷等[6]研究发现，黄酒多酚的抗氧化性能改善糖尿病、心肌病大鼠的心脏功能，降低心肌组织炎症因子和氧化应激水平，抑制糖尿病、心肌病大鼠心肌细胞凋亡。但是这些仅仅是食用菌和料酒单方面的研究，两者共同的效果有待进一步研究。

基于此，本工作主要对酿制出的食用菌料酒中的功能性成分多糖和多酚以及氨基酸和核苷酸进行抗氧化研究和滋味活性研究。结合市场需求研发的以不同食用菌为辅料的料酒，能适合不同口味需求和养生需求的消费者，满足广大消费者的健康需求和消费观念，丰富了中高档料酒，促进了食用菌料酒的深度开发，为食用菌资源在料酒领域的开发利用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：糯米（市售优级），麦曲（生曲自制），酒药（浙江富阳新澄酒曲），水（食用级），杏鲍菇、草菇、猴头菇、海鲜菇、香菇、茶树菇、平菇、灰树花（福建盛耳食品有限公司）。

试剂及耗材：无水乙醇（AR，天津市大茂化学试剂厂），葡萄糖（AR，国药集团化学试剂有限公司），苯酚（AR，天津市永大化学试剂有限公司），浓硫酸（AR，浙江中星化工试剂有限公司），DPPH（HPLC级，源叶生物），没食子酸（AR，国药集团化学试剂有限公司），碳酸钠（AR，浙江中星化工试剂有限公司），福林酚（BR，源叶生物），甲醇（AR，国药集团化学试剂有限公司），甲醛（AR，国药集团化学试剂有限公司），酒石酸钾钠（AR，国药集团化学试剂有限公司），氢氧化钠（AR，国药集团化学试剂有限公司），亚甲基蓝（CP，衡水昊业进出口有限公司），亚铁氰化钾（AR，衡水昊业进出口有限公司），硫酸铜（AR，国药集团化学试剂有限公司），甲基红（IND，津东天正精细化学试剂厂），盐酸（AR，国药集团化学试剂有限公司），硝酸银（AR，国药集团化学试剂有限公司），异硫氰酸苯酯（AR，上海麦克林生化科技有限公司），17种氨基酸和2种核苷酸（美国Sig/Lma公司），乙腈（色谱纯，美国Tedia公司），乙酸钠（AR，国药集团化学试剂有限公司），三乙胺（AR，萨恩化学技术有限公司），甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）。

仪器设备：Waters-600液相色谱仪（Waters公司，美国），UV2550紫外可见分光光度计（岛津企业管理(中国)有限公司），KQ-250DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HH-6系列恒温水浴锅（上海科辰实验设备有限公司），ZD-2自动电位滴定仪（上海雷磁仪器厂），磁力搅拌器（上海凌科实业发展有限公司），Sartorius电子分析天平（德国赛多利斯集团），电热干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），DHg/L-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），水银温度计（北京普特仪表厂），电炉（嘉兴市风桥电热器厂），酒精计（亿达），砂芯过滤装置（江苏悦成）。

1.2 试验方法

1.2.1 食用菌料酒的发酵工艺

浸米：精选优质糯米，将清洗干净的糯米浸泡48 h，水面高出米面10 cm；蒸饭：沥干清水冲清，蒸到外硬内软、疏松不糊、透而不烂、均匀一致；落缸：清水淋浇，饭温控制在28℃，将糯米放入缸内拌酒药，窝洞，加盖保温；前发酵：约48 h后，窝洞有酒液至八分满，再倒入麦曲和放水。24 h后开耙，温度30℃；后发酵：将粉碎成粉末的食用菌添加到罐内，搅拌均匀，发酵30 d；分离：用压榨设备压榨，使酒液和酒糟分离，酒槽综合利用可作燃料，酒液中添加香辛料和食盐（按照文献[1]的方法添加香辛料和食盐）；澄清：利用自然静置法将酒液静置7 d，取其上清液；煎酒：酒液以85℃灭菌30 min。此发酵工艺在浙江圣塔绍兴酒有限公司进行工厂化小型发酵，其发酵工艺见图1，食用菌料酒的生产原料配料表见表1。

1.2.2 8种食用菌料酒理化指标和功能性成分的测定

感官评价：依据SB/T 10416—2007的感官要求进行评价，感官评分由在浙江圣塔绍兴酒有限公司有品酒经验的技术人员和外聘评酒师10人完成，分别以色泽、香气、滋味和体态各25分的评分标准对其进行评价，采用百分制，以平均值计。

图1 食用菌料酒的发酵工艺流程图

表1 8种食用菌料酒生产原料配料表

理化指标测定：总酸（以乳酸计）、氨基酸态氮（以氮计），酒精度采用蒸馏法（以酒精度计），依据SB/T 10416—2007标准；总糖采用亚铁氰化钾滴定法测定（以葡萄糖计），非糖固形物采用烘干测定，pH（以酸度计计），依据GB/T 13662—2008标准。

功能性成分测定：氨基酸含量和核苷酸含量的测定分别参考文献[7]和[8]的方法；多糖含量和多酚含量的测定分别参考文献[9]和[10]以及[11]和[12]的方法。

滋味活性值（TAV）的计算公式：

式中：TAV为滋味活性值；C为各个呈味物质在样品中的浓度；T为对应的味道阈值。

味精当量（EUC）计算公式：

EUC为味精当量(gMSG/100 g)；ai为呈味氨基酸(Glu，Asp)的量(g/100 g)；bi为氨基酸相对于MSG的相对鲜度系数(Glu：1；Asp：0.077)；aj为呈味核苷酸(5'-GMP，5'-IMP)的量(g/100 g)；bj为呈味核苷酸相对于IMP的相对鲜度系数(5'-GMP：2.3；5'-IMP：1)；1218是协同作用系数。

表2 40种食用菌料酒的感官评分、40种食用菌料酒理化指标范围和8种最佳配方的食用菌料酒的理化指标

DPPH的计算公式：

式中：A为DPPH与无水乙醇的吸光度；B为样液与无水乙醇的吸光度；C为DPPH与样液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 40种食用菌料酒的基础评价

2.1.1 食用菌料酒的生产工艺评价

本研究采用共同发酵法的生产工艺酿造食用菌料酒，是多糖、多酚等功能性成分的良好载体，还富含氨基酸、核苷酸等营养成分。该生产工艺可应用于大规模工业化生产，在原有的酿造设备中即可进行生产，发酵工艺简单，酿造的料酒符合现代人健康理念且具有较好营养价值。

2.1.2 40种食用菌料酒的感官评价（表2）

由表2可知，40种食用菌料酒的整体感官水平较好。由于0.5%的添加量过少，使料酒色泽呈淡黄色、口感淡薄；10%的添加量虽然营养成分含量较高，但是由于添加量过多，食用菌的菌香味浓厚，掩盖了料酒本身的醇香味；整体来说，添加量为2.5%、5%和7.5%的料酒其色泽纯正、酒体澄清、口感醇厚，酒香和食用菌香气融为一体。其中，猴头菇料酒的感官评价得分均较高，可能是猴头菇中的有效成分更容易溶于酒体，灰树花料酒的感官得分较低。

2.1.3 40种食用菌料酒的理化指标评价

40种食用菌料酒的不同添加量的理化指标的趋势图如图2所示（所有理化指标的图标注释均按pH值的注释）。

由表2和图2可知，总糖、总酸、氨基酸态氮、非糖固形物和pH值随着添加量的增加而增加，酒精度和添加量之间没有实质性的规律。究其原因，食用菌中含有丰富的多糖，多糖分解生成单糖和二糖，所以随着食用菌添加量的增加和后发酵的复杂反应，生成的总糖含量也随之增加[13]；总酸含量增加可能是食用菌中含有丰富的微生物，这些有益菌随着添加量的增加，代谢产酸也就越多[14]；食用菌中含有大量的蛋白质，因此随着食用菌含量的增加，蛋白质含量在增加，蛋白质水解生成氨基酸态氮的含量也随之增加[15]；总酸和氨基酸态氮的增加使非糖固形物的含量也随着添加量的增加而增加；虽然酸度升高，但由于后发酵的过程缓慢及时间长，酒精的累积、大分子物质的分解及弱碱性物质(碱性氨基酸、核苷酸、高级醇等)的大量增加[16]，致使随着食用菌添加量的增加，pH值也随之增大。食用菌料酒的酒精度并没有规律性的变化，其原因可能是主发酵和后酵前期阶段主要是酒精的累积过程，因此在后酵中添加食用菌对料酒的酒精度没有显著影响。

图2 40种食用菌料酒的理化指标趋势图

其中草菇料酒和茶树菇料酒中总糖含量偏高，茶树菇料酒中的总酸含量最高，茶树菇料酒、平菇料酒、海鲜菇料酒和草菇料酒的氨基酸态氮含量超过了1 g/L，酒精度较高的是杏鲍菇料酒和灰树花料酒，香菇料酒的非糖固形物含量较高，草菇料酒的pH值含量较高。由此可见，各食用菌同料酒共同发酵其营养物质不同，其对应的理化指标表现的风味活性成分的含量也不同。

综上所述，这40种食用菌料酒均达到SB/T 10416—2007规定的酒精度、氨基酸态氮和总酸的行业标准的指标要求；调味料酒行业标准没有严格要求的总糖、非糖固形物和pH值的理化指标参照GB/T 13662—2008的要求，除了少数料酒因添加量过多而致使pH值过大外，总糖和非糖固形物均在国标范围。由于不同的食用菌色泽、口味和所含的营养成分（糖分、氨基酸、核苷酸、蛋白质）的含量的不同，各食用菌参与料酒后发酵微生物的代谢也不尽相同。因此，综合考虑料酒的色泽、口感和理化指标，选择杏鲍菇7.5%、草菇7.5%、猴头菇10%、海鲜菇5%、香菇2.5%、茶树菇5%、平菇7.5%和灰树花10%的添加量作为各料酒最佳的添加量。筛选出的8种最佳配比食用菌料酒的理化指标如表2所示，均满足标准要求。

2.2 8种食用菌料酒滋味研究

2.2.1 8种食用菌料酒的呈味游离氨基酸

氨基酸态氮为料酒行业标准中的重要指标，也是酿造料酒中原料经蛋白酶分解成氨基酸的特征性指标。氨基酸是料酒鲜味的主要来源，氨基酸中具有鲜、甜、苦、涩、酸、咸等多种味感，正是这些多种、多味的氨基酸，赋予料酒丰富的味觉层次，使酒具有鲜美、醇和、浓郁、柔润、协调和多滋多味的特征[17]。在烹制过程中，氨基酸成分与盐结合，生成氨基酸钠盐即呈味成分。然而不同氨基酸的滋味贡献程度主要由味道强度值TAV表示，其中TAV值大于1时，说明该呈味物质对产品的滋味有显著影响，当TAV值小于1时，该呈味作用不显著[18]。杏鲍菇料酒（代表）的呈味游离氨基酸的色谱图如图3所示（其他7种类似，此处不再赘述）。

17种氨基酸的标准曲线回归方程见表3。

经表3标准曲线方程计算得到的氨基酸含量和TAV值见表4。由表4可知，平菇料酒的总游离氨基酸含量最高（8632.3 mg/L），高于龚金炎[19]检测到的传统手工黄酒的总游离氨基酸（7397.1 mg/L），其次为灰树花料酒（5942.86 mg/L）和杏鲍菇料酒（5842.5 mg/L），猴头菇料酒（5445.59 mg/L）、茶树菇料酒（5267.75 mg/L）和草菇料酒（5213.89 mg/L）基本在一个水平上，海鲜菇料酒（4702.16 mg/L）和香菇料酒（3693 mg/L）含量较少，其中香菇料酒的总游离氨基酸的含量最少。总体来说，食用菌料酒的总游离氨基酸含量差距较大，可能与食用菌中的生物活性成分有关。游离氨基酸含量较高的（大于450 mg/L）为谷氨酸、精氨酸、丙氨酸和亮氨酸。其中，TAV值大于1的为谷氨酸、精氨酸和丙氨酸，谷氨酸和丙氨酸分别为鲜味和甜味的代表氨基酸，精氨酸[20-21]既有甜味又有苦味，因此此食用菌料酒中的氨基酸的主要滋味物质为鲜甜味[22]。

图3 杏鲍菇料酒17种游离氨基酸色谱图

2.2.2 8种食用菌料酒的呈味核苷酸

表3 17种氨基酸的标准曲线回归方程

呈味核苷酸主要包括5'-GMP，5'-IMP等，与谷氨酸钠等鲜味氨基酸的鲜味协同效应采用味精物质的量（EUC）法分析。8种食用菌料酒的核苷酸色谱图见图4。

图4 8种食用菌料酒的核苷酸色谱图

图5 食用菌料酒GMP和IMP的标准曲线图

5'-IMP和5'-GMP的标准曲线回归方程见图5。

表4 8种食用菌料酒的呈味游离氨基酸、呈味核苷酸和味道强度值(TAV值)

经图4和图5的含量计算，由表4可知，8种食用菌料酒检测到的IMP的含量在14.7～59.53 mg/L之间，GMP的含量在26.04～58.32 mg/L之间，其核苷酸鲜味值同文献[23]对30种酱油的关于GMP和IMP均值58.87 mg/L和37.16 mg/L相当。这8种食用菌料酒中平菇料酒的IMP和GMP含量最高，海鲜菇料酒的含量最低。由TAV值可得，GMP的TAV值要远远高于IMP的值，说明GMP为食用菌料酒核苷酸的主要滋味物质。

2.2.3 8种食用菌料酒的等鲜浓度值（EUC）

呈味氨基酸和呈味核苷酸能共同影响食用菌料酒的滋味，其可用EUC表示。EUC表示的是呈味核苷酸与鲜味氨基酸混合物协同作用所产生的鲜味强度相当于所产生的鲜味强度所需单一味精的量[24]。由天冬氨酸、谷氨酸、IMP和GMP计算的EUC值见表5。

表5 8种食用菌料酒EUC值 (MSG/100 g)

由表5可知，其中灰树花料酒的EUC值（1.33 MSG/100 g）最高，即100 mL食用菌料酒的鲜味强度与1.33 g MSG（味精）所产生的鲜味强度相当。其次含量较高的为平菇料酒，EUC值为1.03 MSG/100 g，其鲜味强度也较高。其中香菇料酒和海鲜菇料酒的EUC含量较低。海鲜菇料酒中的游离氨基酸含量比香菇料酒的含量高1000 mg/L，香菇料酒的核苷酸含量仅比海鲜菇料酒的含量高10 mg/L，但是在EUC含量上香菇料酒高于海鲜菇料酒，由此可验证文献[22]，适量的核苷酸有显著的助鲜作用。除了谷氨酸、精氨酸和丙氨酸含量的TAV值大于1，草菇料酒和灰树花料酒的缬氨酸TAV值、平菇料酒的TAV值以及茶树菇料酒、平菇料酒和灰树花料酒的TAV值均大于1，说明不同料酒的特征滋味成分和含量的不同，形成各自特有的滋味以及口感。

2.3 8种食用菌料酒多糖和多酚的抗氧化性研究

多糖与多酚的标准曲线回归方程见图6和图7。

图6 多糖含量的标准曲线

2.3.1 8种食用菌料酒多糖的含量

经标准曲线方程计算得到的多糖含量和自由基清除率见表6。

图7 多酚含量的标准曲线

表6 8种食用菌料酒的多糖含量和自由基清除率

2.3.2 8种食用菌料酒多酚的含量

经标准曲线方程计算得到的多酚含量和自由基清除率见表7。

表7 8种食用菌料酒的多酚含量和自由基清除率

2.3.3 8种食用菌多糖和多酚的抗氧化性研究

8种食用菌多糖和多酚的抗氧化性研究见图8、图9。

由图8可知，多糖的含量大小顺序为茶树菇料酒＞香菇料酒＞草菇料酒＞猴头菇料酒＞平菇料酒＞杏鲍菇料酒＞海鲜菇料酒＞灰树花料酒；多糖的DPPH自由基清除率的大小顺序为草菇料酒＞香菇料酒＞茶树菇料酒＞猴头菇料酒＞平菇料酒＞杏鲍菇料酒＞灰树花料酒＞海鲜菇料酒；多酚的含量大小顺序为草菇料酒＞平菇料酒＞香菇料酒＞茶树菇料酒＞杏鲍菇料酒＞灰树花料酒＞海鲜菇料酒＞猴头菇料酒；多酚的DPPH自由基清除率的大小顺序为草菇料酒＞香菇料酒＞茶树菇料酒＞平菇料酒＞灰树花料酒＞杏鲍菇料酒＞海鲜菇料酒＞猴头菇料酒。多糖和多酚的含量与DPPH自由基清除率均表现出一定的相关性（呈现一致的变化关系），多糖与多酚的含量与抗氧化能力顺序基本一致，即含量越多，DPPH自由基清除率越强。但是，其含量和自由基清除率却不是完全一致的顺序，究其原因，可能是在醇沉多糖时，食用菌料酒中的蛋白质、鞣质和糠醛酸[25]也不溶于无水乙醇，这些物质随多糖共同沉淀下来，并且共同溶解在蒸馏水中，从而DPPH自由基的单电子被捕捉的就多；同理，多酚也是一样，不仅多酚可与福林酚试剂反应，蛋白质[26]（蛋白质分子中含有酚基的氨基酸如酪氨酸和色氨酸等）也可以与之反应，也能使抗氧化能力增强，因此，其含量与DPPH自由基的抗氧化能力并不是完全一致。

图8 8种食用菌料酒多糖、多酚的含量与DPPH清除率的关系

图9 多糖与多酚的含量对比关系以及多糖与多酚DPPH自由基清除率对比关系

由图9可知，草菇料酒中多糖和多酚的含量均较高，茶树菇料酒中多酚的含量与多糖的含量较其他料酒相比相差悬殊。其中，茶树菇料酒和香菇料酒中含有较多的多糖，具有的抗氧化能力较强，此结果与文献[27-28]报道的结果一致；草菇料酒、香菇料酒、茶树菇料酒和平菇料酒中的多酚含量均超过了糯米红曲黄酒[29]、王致和料酒和珍极料酒[30]等多种品种的黄酒和料酒。

由图9可知，在多糖含量远远超过多酚含量的情况下，多酚与DPPH自由基清除率的相关性显著高于多糖与DPPH的相关性，这种现象可能与发酵过程中有效成分的水解、异构化和生物大分子间的相互作用有关，亦与抗氧化作用机理密切相关[31]。酚类物质的抗氧化机制是芳香烃中苯环含有酚羟基（具有供氢的活性），可通过氢原子转移和质子耦合的电子传递方式清除自由基[32-33]，食用菌料酒中不仅有料酒本身的没食子酸、儿茶素、表儿茶素、香草酸、香豆酸、阿魏酸、槲皮苷、咖啡酸等多种酚类物质[34]，而且还有食用菌中尿黑酸、安息香酚、羟基肉桂酚[35-36]等不常见的酚类物质，它们均具有酚性羟基，均能清除氧自由基，因此抗氧能力比较强；多糖的抗氧化机制仍不明确，但有研究发现，多糖一般与蛋白质结合通过传递一个电子或者去氢的机制清除活性氧自由基而发挥抗氧化作用[37]，因此还可能与蛋白质的含量有关，多糖的抗氧化能力弱可能是因为蛋白质的含量低，其机制还有待进一步研究。由图9可知，草菇料酒、香菇料酒和茶树菇多糖和多酚均具有较好的自由基清除率，且草菇料酒＞香菇料酒＞茶树菇料酒。

3 结论

本次研发的新型食用菌料酒，同配制酒相比，避免了沉淀的形成；且在后发酵时加入食用菌，既不影响前酵产生的酒精度，且在适量的酒精下，有利于食用菌中的生物活性成分溶出。其生产的新型食用菌料酒，色泽澄清透明、香气醇厚、酒精度低、氨基酸和核苷酸含量丰富、味道鲜爽、抗氧化能力强，且经过漫长的后发酵使食用菌料酒的色、香、味融为一体。

对8种不同食用菌料酒的开发，能满足不同人群的需要。草菇料酒、香菇料酒和茶树菇料酒具有较强的抗氧化能力，符合现代人健康理念且具有较好的营养价值；平菇料酒和灰树花料酒呈香呈味作用较明显，满足现代人对不同口味的需求。