一株耐酸高酯化力细菌的鉴定及发酵条件研究

周榆林，陈 剑，钟明叶，陈梦圆，蔡雪梅，李志军，罗爱民

（1.四川大学轻纺与食品学院，四川成都610065； 2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

中国白酒主要以香味独特、酒体醇厚、优雅细腻、空杯留香等特点而深受消费者喜爱[1-3]。微生物在传统固态白酒酿造过程中对白酒的品质、风味起着至关重要的作用[4]，对其研究具有极高的理论和应用价值。贵州省轻工业科学研究所采用先进的微生物培养和应用技术，用麸皮接种纯菌种发酵，并引入酿造工艺中，这是在国内首次将细菌麸曲应用到酱香型白酒的生产中[5]。滕巍等[6]从大曲中筛选得到1株高产乙酸乙酯酯化酶的霉菌，为提高大曲中酯含量奠定了一定基础。陈梦圆等[7]将1株产酯香功能菌制成纯种麸曲添加到酒醅中，显著改善了酒醅的性质。应用纯种微生物制成麸曲应用到白酒的生产中，是以后科研工作的方向[8]。己酸乙酯作为浓香型白酒的特征香气物质[9]，其含量高低对白酒品质有很大影响。酯化力是衡量大曲生酯生香能力的理化指标[10]，也是反映大曲质量优劣的重要指标之一。因此研究酯化酶活力较高的菌株，增加酒曲的酯化力，对于提高白酒酯香、改善酒质、缩短发酵周期有着重要意义。

四川大学陈剑等[11]从酱香型酒糟中筛选得到1株耐酸产酯细菌ZP-28，此株细菌具有显著耐高温耐酸特性，且酯化力较高，将其应用在麸曲中具有明显改善麸曲品质的作用。本课题在此基础上以该菌株为研究对象，采用分子生物学方法对其进行鉴定，并利用活菌计数法和分光光度法两种不同的方法测定其生长曲线，采用单因素实验考察了温度、培养时间、接种量等培养条件对酯化力的影响，并在此基础上采用正交法对上述发酵条件进行了优化，对改进制曲工艺，提高白酒酯香提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌株：从四川某酒厂的堆积成熟酒糟中分离筛选得到的1株耐酸产酯香细菌ZP-28，现保存于四川大学食品科学与新技术研究室。

试剂：本实验中应用的生化试剂均为分析纯及以上级别，溶液由蒸馏水配制。

牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g。pH调节至7.0～7.2，121℃、0.1MPa条件下灭菌20 min后，冷却倒平板，备用。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化钠10 g，pH调节至7.0～7.2，121 ℃、0.1MPa条件下灭菌20 min后冷却，备用。

麸皮培养基：麸皮和稻壳按照8∶2的比例混匀，加水拌匀，加水量为总质量的65%，润粮2 h。结束后进行蒸煮，将锅放于电炉上加热，待有水蒸汽冒出后开始计时1 h，每隔15 min将原料翻1次，以保证均匀性。蒸煮结束后，将原料按10%比例装瓶，放入灭菌锅内，121℃高压灭菌30 min。

仪器设备：MJ-250型恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）、pHS-3C型酸度计（杭州奥力龙仪器有限公司）、SW-CJ-ID双人单面超净工作台（江苏净化设备公司）、721紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、YXQ-LS-30SII立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备）、2720 thermal cycler PCR 仪（Applied Biosysterms）、DYCP-31 DN电泳槽(北京六一仪器厂)、DYY-5稳压电泳仪(北京六一仪器厂)、FR980凝胶成像仪(上海复日科技仪器有限公司)、HC-2518R冷冻高速离心机(BBI)、3730XL测序仪(Applied Biosystems)。

1.2 实验方法

1.2.1 分析方法

酯化力测定：参照QB/T 4257—2011。

1.2.2 分子生物学鉴定方法

1.2.2.1 菌株DNA提取过程（1）称取纯种麸曲0.5 g，置于2 mL离心管中。（2）向离心管中加入1 mL裂解液，漩涡充分混匀。

（3）将离心管置于-20℃条件下冷冻40 min，取出后65℃水浴溶解。

（4）将离心管置于-20℃条件下冷冻20 min，取出后65℃水浴溶解。

（5）将离心管置于-20℃条件下冷冻15 min，取出后65℃加热30 min。

（6）10000 r/min离心10 min，取上清液550 μL转移至新的1.5 mL离心管中，应避免吸到沉淀。

（7）向离心管中加入200 μL无水乙醇，漩涡瞬时混匀。

（8）按Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒的步骤提取。

（9）提取的DNA样品于-20℃下保存备用。

1.2.2.2 PCR扩增体系及程序

以细菌的基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，PCR扩增体系见表1。引物序列如下：

表1 16S rDNA PCR扩增体系

循环参数：预变性94℃维持4 min，之后30个循环的94℃变性45 s、55℃退火45 s和72℃延伸1 min，再以72℃修复延伸10 min。

琼脂糖凝胶电泳：PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测判断是否为阳性扩增。样品和Marker的上样量为4 μL。设定电压为150 V，电泳时间15 min。接通电极，PCR产物由阴极向阳极移动。电泳结束后用FR980凝胶成像仪观察。

1.2.2.3 PCR扩增产物纯化和测序

成像观察结束后，用干净的手术刀片将含有目的片段的琼脂糖凝胶块切下，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，对含有目的DNA片段进行纯化回收，回收效率可达80%，该试剂盒的膜结合液中不含有干扰酶活性的碘化钠。最后洗脱得到的DNA溶液置于-20℃下保存或用于后续实验。PCR产物用PCR引物直接测序。

1.2.2.4 序列比对方法

序列结果用NCBI在线工具Blast在Gene Bank内与标准菌株比对，并用MEGA5.0软件构建系统发育树。

1.2.3 菌株ZP-28生长曲线的测定方法

活菌计数法是将一定浓度的发酵菌液适当稀释后均匀涂布于平板上，培养一定时间后计量菌落数，绘制“培养时间-活菌数量”的关系图。活菌计数测定法步骤为，与生长曲线法采用同一体系菌液，根据预实验的结果将发酵液稀释适当倍数后再涂布至牛肉膏蛋白胨固体培养基表面，每组实验3个平行，37℃恒温培养箱培养后计数，并根据稀释倍数计算每毫升菌液中的活菌数量。分光光度法则是根据菌悬液的透光量间接测定细菌的浓度，因为细菌悬浮液的浓度在一定范围内与吸光度成正比，可以用吸光度反映菌浓度。选择在37℃温度培养条件下，测定ZP-28号菌株在LB培养基中吸光值变化曲线，以未接种的培养基为空白样，每隔1 h吸取3 mL培养基以进行OD值测定，并做活菌计数实验，可以判断菌体生长状况。

1.2.4 发酵条件的优化实验

选取培养时间、培养温度和接种量3因素考察对酯化力的影响。

1.2.4.1 培养时间对酯化力的影响

在37℃，3%接种量条件下，研究培养时间的影响，分别在48 h、60 h、72 h、84 h 4个培养时间下测定酯化力的大小，培养结束后取出，40℃烘干，保持水分在14%左右，取出粉碎测酯化力。每个时间做3个平行，重复3组实验。

1.2.4.2 接种量对酯化力的影响

在37℃、72 h培养时间条件下，研究接种量的影响，分别以1%、2%、3%、4%4个接种量下测定酯化力的大小，培养结束后取出，40℃烘干，保持水分在14%左右，取出粉碎测酯化力。每个接种量做3个平行，重复3组实验。

1.2.4.3 培养温度对酯化力的影响

在3%接种量、72 h培养条件下，研究培养温度的影响，在37℃、42℃、47℃、52℃ 4个培养温度下测定酯化力的大小，培养结束后取出，40℃烘干，保持水分在14%左右，取出粉碎测酯化力，测定方法见1.2.1。每个温度做3个平行，重复3组实验。

1.2.4.4 正交实验

正交实验设计方法可通过少量的实验点来获得整个实验域内丰富的实验信息，从而得出全面的结论，因此具有设计灵活、不需要获得导数信息、实验次数少、可靠性高、可多方向同时寻优等特点。本实验为3因素4水平正交实验，正交实验因素水平见表2。

2 结果与讨论

2.1 ZP-28的分子生物学鉴定结果

PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测判断是否为阳性扩增。样品和Marker的上样量为4 μL。设定电压为150 V，电泳时间15 min。接通电极，PCR产物由阴极向阳极移动。电泳结束后紫外成像观察，结果见图1。

表2 正交实验表

图1 PCR扩增跑胶结果

将测序所得到的16S rDNA全序列利用CExpress完成拼接，提交到Gene Bank数据库，并应用Blast软件进行同源性搜索，序列结果用NCBI在线工具Blast在Gene Bank内与标准菌株比对，并用MEGA5.0软件构建系统发育树，如图2所示，确定ZP-28是枯草芽孢杆菌。

2.2 ZP-28的生长曲线测定结果

ZP-28的生长曲线测定结果见图3，左垂直轴是OD值，右垂直轴是活菌总数的对数值。由图3可知，将菌株接种到LB液体培养基后，在0～6 h期间，OD值和活菌总数增加较慢，表明该菌株的生长很缓慢，此段时期内该菌株处于延迟期；在6～24 h期间，OD值和活菌总数增加较快，表明该菌株生长速率最大，属于对数生长期，该时期内菌体数量在大量迅速的增加，当生长到15 h时达到对数生长期的中期，取此时期的微生物作为种子液可以保证菌种的活性达到快速增殖的效果；培养24 h后，OD值和活菌总数增加较慢，表明该菌株进入稳定生长期，也是积累代谢产物的一个阶段，该期OD值有不显著的上升，这可能是因为菌体细胞死亡后仍在培养液中，这会影响到吸光度的测定，从而使OD值仍有缓慢的上升迹象；30 h后，OD值和活菌总数有下降趋势，这表明由于营养物质的消耗和代谢产物的积累抑制了微生物的生长繁殖，菌体量开始缓慢下降，OD值也随着有所降低。

2.3 麸皮培养基优化实验结果

图2 基因构建系统发育树

图3 生长曲线

2.3.1 培养时间对酯化力的影响

在37℃，3%接种量条件下，研究不同培养时间下酯化力高低，实验结果见图4。由图4可知，随着培养时间的延长，酯化力呈先增加后降低的趋势。培养时间为48 h时，酯化力较低，其发酵不完全。当培养时间为60 h时，麸曲的酯化力最高，与48 h的发酵产物酯化力相比有了较高的提高。继续延长培养时间，酯化力不增反而呈降低趋势。

图4 不同培养时间的酯化力

2.3.2 接种量对酯化力的影响结果

在37℃，72 h培养时间条件下，研究不同接种量对酯化力的影响，实验结果见图5。由图5可知，随着接种量的增加，酯化力先增高后降低。接种量为1%时，发酵产物的酯化力较低。当接种量为2%时，麸曲的酯化力最高，与1%接种量的发酵产物相比有了明显的提高。之后增大菌种的接种量，发酵产物的酯化力没有明显的提高。

2.3.3 培养温度对酯化力的影响

在3%接种量、72 h培养条件下，研究不同培养温度对酯化力的影响，实验结果见图6。由图6可知，随着培养温度的提高，酯化力先增高后降低。培养温度为37℃时，发酵产物的酯化力随着培养温度的增加不断提高，当培养温度为47℃时，麸曲的酯化力最高，随后再提高培养温度麸曲的酯化力呈现一定的下降趋势。

图5 不同接种量的酯化力

图6 不同培养温度的酯化力

2.3.4 正交实验结果

单因素实验结果显示，选取的培养条件为：培养时间60 h，接种量2%，培养温度47℃。为了更好地研究三因素之间的相互作用，进行正交实验研究。如表3所示，正交实验验证结果表明：RC＞RA＞RB，所以各因素的主次顺序为C＞A＞B，即接种量对酯化力影响最大，其次是培养温度，对酯化力影响最小的是培养时间。选择K值最大所对应的培养条件，即接种量为2%，培养温度37℃，培养时间72 h，在该培养条件下预计酯化力较高。

由正交实验结果选择最佳培养条件，即接种量为2%，培养温度37℃，培养时间72 h。根据该条件将2%种子液接种到麸皮培养基，于37℃恒温培养箱培养72 h，每隔几小时摇匀1次，培养结束后取出烘干粉碎，测酯化力，结果为33.6 U±0.021 U，比其他培养条件下酯化力都要高，进一步验证了正交实验结果的准确性。

表3 正交实验结果

3 结论

将1株从郎酒酒糟中筛选得到的耐酸产酯香细菌ZP-28采用分子生物学鉴定，根据该菌株的16S rDNA序列分析结果显示，该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。测定了ZP-28菌的生长动态，在6～24 h期间，该菌株生长速率最大，属于对数生长期，该时期内，一方面菌体数量在大量迅速的增加，培养24 h后该菌株进入稳定生长期，在菌株培养末期OD值有不显著的上升。因为菌株生长到15 h时，达到对数生长期的中期，取此时期的微生物作为种子液可以保证菌种的活性达到快速增殖的效果，最终确定菌液培养时间为15 h。以该菌株为出发菌株，分别从温度、接种量、培养时间3方面设计单因素实验研究发酵条件，在单因素实验基础上采用正交法设计实验对ZP-28发酵条件进行优化。正交结果显示，接种量对酯化力影响最大，其次是培养温度，对酯化力影响最小的是培养时间。最终确定在培养温度37℃，培养时间72 h，接种量为2%的条件下得到的麸曲的酯化力较高，为33.6 U±0.021 U。深入生产实践，还需要进一步进行工厂发酵实验探讨研究。