益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

张兆康 ，倘孟莹 ，滕月 ，张丽霞

青光眼（glaucoma）是一种眼科常见疾病，其发病迅速、危害性大且不可逆转，且具有隐匿性、遗传性等特点，是导致人类失明的三大致盲眼病之一［1］。它是以视神经结构、视功能状态改变及视网膜神经纤维缺损为特征的视神经退行性疾病。根据世界各地流行病研究［2］，到2020年和2040年全球青光眼人数将分别达到7960万和1.118亿。青光眼视神经保护药物种类不少，新的药物也不断推出，但疗效都存在一定局限性［3］。本项目通过烧灼巩膜上静脉法建立持续性高眼压动物模型,评价益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells，RGCs）凋亡的影响，为该中药临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雄性大鼠7～8 w龄 60只,体重约180～220g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。“益精杞菊地黄颗粒”由枸杞子配方颗粒、菊花配方颗粒、熟地黄配方颗粒、山萸肉配方颗粒、泽泻配方颗粒、茯苓配方颗粒、黄芪配方颗粒等组成，由中国中医科学院眼科医院药剂科提供，加适量水溶解，无菌密封后放入4℃冰箱保存。

1.2 分组及模型建立

1.2.1 实验分组及给药 将“益精杞菊地黄颗粒”临床成人剂量（mg/kg）的 5倍、10倍、20倍，分别定为高剂量中药组、中剂量中药组、低剂量中药组，每组大鼠各12只，高、中、低剂量中药组分别给予不同浓度的颗粒剂灌胃给药。模型组与对照组给予等量的生理盐水灌胃。

1.2.2 高眼压动物模型的建立 根据烧灼巩膜上静脉法制成慢性高眼压模型［4］。术前左氧氟沙星眼药水冲洗眼部（右眼）消毒，于上睑中点做牵引缝线以拉开眼睑。在显微镜下，沿角膜缘外2 mm处行放射状的切口剪开外侧及上方球结膜，仔细分离筋膜和肌肉，可发现暴露鼻上、颞上和颞下象限2或3条巩膜上静脉，用眼科手术止血器烧灼这3支巩膜上静脉，烙闭成功的标志即烧灼处静脉血流消失，近端静脉充血怒张。术后用生理盐水冲洗结膜囊，平复球结膜，复方妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。大鼠的平均眼压在22 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上者则为造模成功。

1.2.3 取材及标本制备灌胃给药4 w后进行取材，将大鼠过量麻醉处死，快速摘取右眼眼球，留取部分球后视神经组织，4%多聚甲醛（4℃）中固定24 h，石蜡包埋备HE染色、Tunel实验用。

1.3 检测方法

1.3.1 眼压测量 用Tono-pen AVIA笔式眼压计测量眼压。测量时予盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉，眼压计轻触角膜10次，自动读取眼压值（去除变异系数＞5%的数值）。每次测量眼压均在上午10点左右，由同一人进行完成，每次每只眼测量3次，取平均值。分别于造模前、造模后即刻及造模后每周测量1次,共1个月。

1.3.2 HE染色 石蜡切片常规脱腊至水化；采取苏木素-伊红染色，经75%乙醇1×10 s，85%乙醇Ⅱ1×10 s，95%乙醇Ⅰ1×30 s、乙醇Ⅱ1×30 s，100%乙醇Ⅰ1×3 min、100%乙醇Ⅱ1×3 min、100%乙醇Ⅲ1×3 min，二甲苯Ⅰ1×3 min、二甲苯Ⅱ1×3 min、二甲苯Ⅲ1×3 min进行脱水透明。中性树胶封片，风干,光镜下观察各组大鼠视网膜的形态结构及大鼠RGCs层细胞数量。

1.3.3 TUNEL检测 石蜡切片常规脱腊至水化;0.25%Triton X-100柠檬酸钠溶液（0.1%）4℃反应30 min；制备TUNEL反应混合液，处理组用TdT50 μl+荧光素标记的dUTP液450 μl混匀；而阴性对照组仅加50 μl荧光素标记的dUTP液；玻片干后，处理组滴加TUNEL反应混合液50 μl，阴性对照组滴加dUTP 液 50 μl，置 37℃湿盒中 1 h；滴加 DAPI300 μl于标本上，室温下5 min；玻片干后，用抗荧光衰减封片剂封片，风干，荧光显微镜下观察并拍照。观察各组大鼠RGCs的凋亡情况，计算出大鼠RGCs层的凋亡阳性细胞率。

1.4 统计学分析

所有数据采用SPSS17.0软件包进行统计学分析，定量指标以均数±标准差（）表示。多组间的比较用完全随机设计的单因素方差分析（One-way ANOVA）。两组间的多重比较，采用LSD-t检验，各组与对照组或模型组的比较，采用Dunnett t(2-sided)。自身的前后对照比较用配对t检验（Paired-samples T Test）,当 P＜0.05，则认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 眼压测量结果

造模前大鼠眼压平均为 （12.90±1.23）mm Hg，各组大鼠眼压比较无统计学意义（P＞0.05）。造模后用药前，模型组及高、中、低剂量中药组的大鼠眼压明显升高，与造模前比较有统计学意义(P＜0.01)，与空白组比较，有统计学意义（P＜0.01)，说明造模成功；而模型组与各用药组大鼠眼压比较，无统计学意义（P＞0.05），说明各组间均衡、有可比性。用药后1个月，模型组及高、中、低剂量中药组与造模前比较有统计学意义（P＜0.01），与空白组比较有统计学意义（P＜0.01)；模型组及各用药组与造模后用药前比较，无统计学意义（P＞0.05），但各用药组眼压有所下降；模型组眼压与各用药组比较，无统计学意义（P＞0.05）；中药各用药组间比较，无统计学意义 （P＞0.05）。 见表1

表1 各组大鼠造模及用药前后的眼压比较(，n=12)(单位:mm Hg)

表1 各组大鼠造模及用药前后的眼压比较(，n=12)(单位:mm Hg)

注：▲与造模前比较，P＜0.01，有统计学意义。*与模型组比较，P＜0.01，有统计学意义。#与空白组比较，P＜0.01，有统计学意义。

组别 造模前 造模后用药前 用药后1个月空白组 13.36±1.80 13.27±1.67* 13.00±0.33*模型组 12.91±1.57 34.81±1.99▲# 32.55±1.96▲#高剂量中药组 12.36±1.56 35.64±1.12▲# 32.91±1.75▲#中剂量中药组 12.96±1.43 35.54±1.43▲# 33.00±1.34▲#低剂量中药组 13.55±1.44 34.98±1.53▲# 32.04±1.41▲#

2.2 HE染色观察各组大鼠视网膜的病理变化

2.2.1 大鼠视网膜形态结构 空白组视网膜组织结构完整，各层次分明、排列整齐，视网膜神经节细胞（RGCs）单层排列，形态规则，内、外核层排列整齐，无异常。模型组大鼠视网膜结构不完整，RGCs数量明显减少、排列十分紊乱、形态不规则，部分细胞胞核裂解、变性，内、外核层排列疏松。中剂量中药组大鼠视网膜各层次基本分明，RGCs排列较整齐，形态较规则，数量无明显减少，内外核层排列稍紊乱。高、低剂量中药组大鼠视网膜组织结构破坏，RGCs数量减少、排列较紊乱，内外核层排列较疏松。见图1

2.2.2 大鼠RGCs层细胞数量 模型组RGCs层细胞数量较空白组显著减少（P＜0.01），差异有统计学意义。与模型组相比，高、中剂量中药组RGCs层细胞数量较多（P＜0.01），差异有统计学意义；低剂量中药组与模型组相比，无统计学意义（P＞0.05）。见表2

2.3 Tunel检测各组大鼠RGCs凋亡结果

干预1个月后，空白组大鼠RGCs层中未见细胞凋亡，模型组大鼠RGCs层中TUNEL阳性细胞明显表达，内、外核层存在细胞凋亡，中剂量中药组大鼠RGCs层中TUNEL阳性细胞少量表达，低、高剂量中药组表达较多。见图2

各组大鼠RGCs中凋亡率分别为空白组（4.32±4.05）%、 模型组 （31.49±2.27）%、 高剂量中药组（26.64±2.51）%、中剂量中药组（12.91±1.44）%、低剂量中药组（27.43±22.51）%。空白组与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)；中剂量中药组较模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)；高、低剂量中药组较空白组，差异有统计学意义(P＜0.01)，较模型组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2

表2 各组大鼠RGCs层细胞计数及视网膜神经节细胞凋亡率比较（，n=12）

表2 各组大鼠RGCs层细胞计数及视网膜神经节细胞凋亡率比较（，n=12）

注：* 与模型组比较，P＜0.01；# 与空白组比较，P＜0.01

组别 RGCs层细胞计数 凋亡率（%）空白组 17.33±1.79* 4.32±4.05*模型组 9.37±1.71 31.49±2.27#高剂量中药组 13.30±1.41* 26.64±2.51#中剂量中药组 15.32±1.46* 12.91±1.44*#低剂量中药组 10.52±1.31 27.43±22.51#F 122.52 120.98 P＜0.001 ＜0.001

图1 光学显微镜下各组大鼠的视网膜结构（400× HE）1A 空白组；1B 模型组；1C高剂量组；1D中剂量组；1E低剂量组

图2 荧光显微镜下各组大鼠视网膜节细胞的凋亡 （200×TUNEL）2A 空白组；2B 模型组；2C高剂量中药组；2D中剂量中药组；2E低剂量中药组。白箭头指凋亡细胞

3 讨论

3.1 动物模型的制备与思考

青光眼的动物模型大多是通过升高眼压而达到实验模拟青光眼视神经损害的目的。青光眼造模方法很多，且在不同时期曾广泛应用，但各有利弊。目前常用的慢性高眼压模型建立方法主要有前房注射法、激光光凝巩膜上静脉法、高渗盐水注射巩膜上静脉法、巩膜上静脉烧灼法等[5-7]。

本实验选择烧灼大鼠巩膜上静脉法造模，烙闭SD大鼠的右眼鼻上、颞上和颞下象限3条巩膜上静脉，使房水外流阻力增加。近几年，这种方法被广泛用于动物实验研究中。本实验结果发现术后即刻眼压明显升高，在造模后1个月眼压稳定，保持在高眼压水平，同时病理及细胞凋亡检测结果显示，随着高眼压损伤时间持续，RGCs结构呈进行性损害，RGCs层细胞数量不断递减，RGCs层凋亡率显著增加，与国内外研究一致[4,8]。因此，该实验慢性高眼压模型建立是成功的。综合国内外文献，该模型方法较成熟，优势在于简单、易于操作、重复性强、成本较低，眼压升高维持时间较长且稳定，并能造成视神经损害，类似于人类青光眼发病过程，有利于青光眼的视神经保护的进一步研究。

3.2 益精杞菊地黄颗粒对视网膜神经节细胞凋亡的保护作用

本实验通过病理学及细胞凋亡检测表明益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠RGCs有保护作用。从组织病理学可以看出模型组大鼠视网膜结构不完整，RGCs排列十分紊乱、形态不规则，部分细胞胞核被破坏，内、外核层排列疏松，RGCs层的细胞数量较空白组显著减少（P＜0.01）。中药中剂量组经治疗后，视网膜各层次基本分明，RGCs形态较规则，排列较整齐，内、外核层排列稍紊乱，RGCs层的细胞数量比模型组多（P＜0.01），差异有统计学意义。中药高、低剂量组类似于模组型的病理变化。从Tunel检测结果显示，模型组大鼠RGCs层中TUNEL阳性细胞明显表达，内、外核层存在细胞凋亡。中药中剂量组TUNEL阳性细胞少量表达，较模型组有统计学意义(P＜0.01)。以上研究结果说明中剂量的益精杞菊地黄颗粒在一定程度上可减少RGCs凋亡，对青光眼神经节细胞有保护作用。

高健生研究员在长期的临床基础上总结出 “益精升阴敛聚法”[9]，并创立了青光眼视神经保护的有效经验方“益精杞菊地黄颗粒”[10]。他认为青光眼是因玄府闭塞，气血津液不行而引发的目系眼病。“玄府闭塞、精血不足、髓海失养”应是青光眼视神经损害的主要病机，故以“疏通玄府、补益肝肾”作为青光眼视神经保护的首要治则。

益精杞菊地黄颗粒剂是根据以上思想，在经典方杞菊地黄丸基础上化裁而成，去山药，加葛根、生黄芪等。方中六味地黄丸可滋补肝肾精血，熟地黄，甘微温，归肝肾经，补血养阴、填精益髓；菊花，苦辛微寒，清热解毒，清疏上焦头目风热，有助于升发阴精；枸杞子，甘平，归肝肾经，滋补肝肾、益精明目。二者入肝经，具有滋阴、养肝、明目之效。既往诸医家，其治多注重补益肝肾，而未考虑到神光即视功能的保护，不只依赖阴精，还要重视气与阳的作用，所以在补阴药基础上辅以补阳药物。生黄芪，味甘，微温，可补气健脾、升阳举陷、益卫固表、利尿消肿、托毒生肌。气为血之帅，生黄芪大补元气，能助血运行，升举清扬之气达目窍，并且取其“阳中求阴”之意，使阴精泉源不竭，上养目窍。补益肝肾之品多质重滋腻，入下焦，但目窍精微，其位高，所以常加入升运精血之升阴药物。葛根，甘、辛，凉，能解肌透疹、生津止渴、升阳止泻，本方取其升发之意，有升发阴精之效。全方合用，共奏滋补肝肾、益精养血明目之功，保护青光眼患者的视功能。现代药理研究，葛根素[11]能扩血管，改善高眼压视神经轴浆流及视盘微循环，防治视网膜损伤。茯苓、泽泻可缓解房水的瘀闭状态，降低眼压。以上诸药相配充分发挥滋补肝肾、益精养血明目的作用，以保护青光眼患者的视功能。

3.3 展望

中药在青光眼视神经保护方面有具有广阔前景和潜力，高健生研究员创立的 “益精杞菊地黄颗粒剂”虽主治目疾，但是从整体观念角度调节全身的脏腑经络、气血津液，体现了中医的“治病求本”治疗原则[12]。本课题从病理学、细胞凋亡等方面观察了益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠RGCs的影响,发现其抑制、延缓RGCs凋亡的作用。

临床上治疗青光眼经验是在 “益精杞菊地黄颗粒剂”基础上联合降眼压药物，所以后续动物实验我们可加入益精杞菊地黄颗粒剂和降眼压药治疗组，进行更深层的观察研究，为临床治疗方案的研究提供理论基础。还可进行拆方处理，探讨方中起主要作用的药物。