苯扎氯铵微生物限度检查方法适用性研究
2018-12-26刘绪平张文婷肖钦钦李景莲
刘绪平 张文婷▲ 肖钦钦 李景莲
1.江西省药品检验检测研究院 江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西南昌 330029；2.江西省医疗器械检测中心，江西南昌 330029
《中国药典》2015年版对微生物限度检查法在前版的基础上做了较大的修订，包括国内已生产的常用辅料要求做微生物限度检查[1]。苯扎氯铵为氯化二甲基苄基烃铵的混合物，白色蜡状固体或黄色胶状体；水溶液显中性或弱碱性反应，振摇时产生多量泡沫。本品在水或乙醇中极易溶解，在乙醚中微溶。苯扎氯铵是一种阳离子表面活性剂，属非氧化性杀菌剂，具有广谱、高效的杀菌能力，在眼用制剂中苯扎氯铵是应用最广泛的防腐剂之一，常用浓度是0.01%～0.02%（W/V），常与其他抗菌剂或赋形剂联合应用，以增强抑制绿脓杆菌性，还可用于医药工业中洁净区地面、台面的表面消毒[2-4]。
1 仪器与试药
1.1 仪器
电子天平 YP601N（上海精科仪器有限公司）；生物安全柜1384 4’BSC（美国赛默飞世尔科技有限公司）；Htysteritest 601 型集菌仪（温州维科生物实验设备有限公司）；KB400霉菌培养箱（德国BINDER公司）。
1.2 试药
苯扎氯铵：批号 20151116、20151119、2015123，生产单位：江西阿尔法高科药业有限公司。培养基和试剂胰酪大豆胨液体培养基（批号：160330）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号：160310）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：160602）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：160602）等均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.3 菌种
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉均购自中国食品药品检定研究院。
2 方法与结果
2.1 微生物计数法的方法适用性试验
2.1.1 实验菌株菌液制备 接种金黄色葡萄球菌至胰酪大豆胨液体培养基于35℃下培养22h，并用0.9%无菌氯化钠溶液10倍梯度稀释至10-4。另外三株细菌同法制备。
表1 需氧菌总数计数方法适用性试验结果
接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基于25℃培养48h，用0.9% 无菌氯化钠溶液10倍梯度稀释至10-2。接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，25℃下培养7d，用含0.05%吐温80 的0.9%无菌氯化钠溶液5mL洗脱斜面上的孢子，用上述稀释液10倍梯度稀释至10-3。
2.1.2 供试液制备 取供试品10mL，加45℃的含10%的吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，置振荡器上摇匀，作为1：10供试液。
2.1.3 试验组
2.1.3.1 需氧菌计数 取1：10供试液1mL，薄膜过滤，每筒用含3%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，总冲洗量为800mL/筒，每次100mL，将不大于100 cfu的实验菌（3株细菌、2株真菌）加入到最后一次冲洗液中，滤干，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂平板上，置35℃培养箱培养。3株细菌培养3d，2株真菌分别培养5d，逐日观察平板生长情况。
2.1.3.2 霉菌和酵母菌总数 试验操作同2.1.3.1，冲洗量为300mL，加入的阳性菌为2株真菌，培养基为沙氏葡萄糖琼脂脂平板，25℃培养5d。
2.1.4 供试品对照组 取上述1：10供试液，薄膜过滤，操作同试验组，不加入试验菌，测定供试液本底菌数。
2.1.5 菌液对照组 取不含中和剂的稀释液替代供试液，同试验组操作加，测定加入的阳性菌数。
2.1.6 中和剂对照组 取含3%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，同试验组操作[5-8]。以上试验结果见表1～2。
表2 霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验结果
2.2 控制菌检查方法的适用性实验
2.2.1 大肠埃希菌
2.2.1.1 试验组 取上述1：10 供试液10mL，薄膜过滤，用含3%吐温80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，总冲洗量为300mL/筒，每次100mL，将小于100 cfu的大肠埃希菌加入到在最后一次冲洗液中，35℃培养24h，取上述培养物1mL接种至100 mL麦康凯液体培养基中，42℃培养24h。将上述培养物划线接种至麦康凯琼脂平板上，35℃培养 48h，观察平板生长情况。
2.2.1.2 阴性对照组 取稀释液10mL照“2.2.1.1”项下方法操作。
2.2.2 金黄色葡萄球菌检查
2.2.2.1 试验组 操作同大肠埃希菌检查试验组，加入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌，选择性平板为甘露醇氯化钠琼脂培养基平板。
2.2.2.2 阴性对照组 取稀释液 10 mL照“2.2.2.1”项下方法操作。
2.2.3 铜绿假单胞菌检查法
2.2.3.1 试验组 同大肠埃希菌检查试验组，加入小于100 cfu的铜绿假单胞菌，选择性平板为溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板。
2.2.3.2 阴性对照组 取稀释液 10 mL照“2.2.3.1”项下方法操作[9-11]。
三株控制菌检查适用性试验结果试验组均检出相应的阳性菌，阴性对照组均无菌生长。
3 讨论
3.1 药用辅料的标准越来越严格
我们日常使用的药品是由药用辅料和主药组成的，这两类物质全程参与了体内的吸收、分布、代谢、排泄过程，可以这样说，过程的安全性决定着药品最终的安全性，所以药用辅料的安全性至关重要。我国药用辅料的管理远不如药品管理严格。药用辅料国家规范的标准较少，而地方级标准较多，标准亦不够完善。这直接影响着药用辅料的管理和使用。《中国药典》自1977年开始收载辅料，品种逐渐增加[12-14]。《中国药典》2015年版药用辅料单独收载在四部，质量要求和安全性控制更加严格。在微生物限度检查方面，制剂通则就明确规定了药用辅料必须做微生物限度检查，标准规定需氧菌总数不得过103（cfu/g或cfu/mL），霉菌和酵母菌总数不得过102（cfu/g或cfu/mL），控制菌检查项目未做统一规定。
3.2 中和剂的选择
苯扎氯铵属于非氧化性杀菌剂，具有广谱、高效的杀菌能力。考虑普通方法不能消除其抑菌性，故而采用薄膜过滤法进行实验，选取敏感菌株金黄色葡萄球菌进行预实验，冲洗液为pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，当冲洗量为500mL/筒时，回收比值为0；冲洗量为800mL/筒时，回收比值仍然为0。由于本品抑菌性太强，考虑使用中和剂消除供试品的抑菌性。由于本品为季铵类化合物所以选择添加3%浓度的聚山梨酯80，当冲洗量为500mL/筒时，回收比值仍然为0，冲洗量为800mL/筒时，3株细菌和2株真菌的回收比值均能达到药典要求。最终我们确定该品种好氧菌检查、霉菌和酵母菌总数检查均采用薄膜过滤法，冲洗液为含3%吐温80的pH7.0无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液，冲洗量分别为800mL/筒和300mL/筒[15]。控制菌检查项目药典未做统一规定。苯扎氯胺作为药用辅料是滴眼剂经常使用的消毒剂：典型的浓度范围为0.004%～0.01%。因其具有表面活性剂的功能，可以溶解泪膜的脂质以及增加药物渗透性，使其成为滴眼剂有用的赋形剂。故而控制菌检查选择大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌三个检查项目。方法均为薄膜过滤法，冲洗液同好氧菌检查，冲洗量均为300mL/筒。
