慢性心力衰竭病人血清miR-451a调控MMP-9的表达及临床意义

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慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是临床常见疾病，是各种心血管疾病恶化的最终结局，其死亡率高达50%，且随着年龄增长，慢性心力衰竭患病率显著上升。研究表明，心肌重塑是慢性心力衰竭发生的重要机制之一[1-2]。在慢性心力衰竭发病过程中，病人血清中相关蛋白水平发生变化，这些变化在疾病的发生发展过程中起着重要作用。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类复杂的内肽酶(锌依赖性蛋白酶)，其活性异常会影响心肌重塑、心肌纤维化、心肌细胞凋亡等过程，在心血管生理和病理中起重要作用，参与心肌细胞外蛋白质合成和降解的调控[3-4]。目前，对慢性心力衰竭发病机制的相关研究已深入到分子生物学水平，基因表达的变化在疾病发生过程中起重要的调节作用。miRNA是长21-25nt的非编码RNA分子，是重要的基因表达调节因子，参与调控机体多种生物学功能。研究表明，多种miRNA在心肌细胞中特异性表达，参与慢性心力衰竭的发生发展过程，且在心肌肥大、心肌凋亡、心肌离子通道改变及心脏功能代谢异常等过程中具有重要的调节作用[5]。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是TargetScan预测的miR-451a靶基因之一。本研究旨在探讨miR-451a与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在慢性心力衰竭病人中的表达情况及相关性，以期为慢性心力衰竭的临床诊断及治疗提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取我院2014年2月—2016年2月确诊为慢性心力衰竭的病人80例作为研究组，其中男44例，女36例；年龄44岁～80岁(57.1岁±6.3岁)；美国纽约心脏病学会(NYHA)分级：Ⅰ级20例，Ⅱ级22例，Ⅲ级26例，Ⅳ级12例。纳入标准：①病程6个月以上；②心力衰竭症状持续6个月以上；③左室射血分数<45%；④左心室舒张末内径，男55 mm以上，女50 mm以上；⑤病人知情同意。排除标准：①合并心脏瓣膜疾病、急性心包炎，有稳定型心绞痛、心肌梗死等心脏疾病；②阻塞性肺疾病；③伴有肝、肾等重要脏器功能障碍；④于近1个月内行经皮冠状动脉介入治疗(PCI)；⑤伴有恶性肿瘤。另选择来我院体检的健康成年人80名作为对照组，其中男45名，女35名；年龄41岁～79岁(56.8岁±5.9岁)。两组年龄、性别等临床资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-451a水平 清晨采集所有病人空腹静脉血5 mL，使用qRT-PCR检测血清中miR-451a表达水平。将细胞数调节至1×106/mL。使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)从细胞提取总RNA。使用Reverse Transcription Kit(Takara，日本)将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green(Takara)进行实时PCR分析。以β-Actin作为内参。利用ABI7500系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR反应。用2-ΔΔCT法计算miR-451a相对表达的倍数变化。qRT-PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃15 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。由上海生工进行miR-451a及内参引物序列的设计合成工作。miR-451a引物序列，上游引物：5′-AAACCGTTACCATTACTGAGTT- 3′，下游引物： miScript SYBR Green PCRkit Universal Primer；U6引物序列，上游引物：5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.2 酶联免疫吸附(ELISA)测定MMP-9的表达水平 采集晨起空腹静脉血5 mL，2 000 r/min离心10 min后，分离血清，使用ELISA法检测血清中MMP-9的表达水平。ELISA检测试剂盒购自云南精赛顿生物制剂公司。除空白孔外，将样品(每孔100 μL)以及不同浓度的标准物质(每孔100 μL)分别加入孔中，反应孔用胶纸密封。37 ℃温育90 min后，将板洗涤4次～6次，干燥。除空白孔外，所有其他孔与生物素抗体(每孔100 μL)混合，37 ℃反应30 min。将板洗涤4次后，进行避光孵育20 min。之后，每个孔依次加入100 μL终止反应液混合以结束反应。将反应板放入酶标仪(BioTek Instruments，Burlington，VT)中，测量OD450值。根据样品的OD值对MMP-9含量进行计数，然后乘以样品的稀释比，获得样品MMP-9的实际含量。将平均值作为相对数量。

2 结 果

2.1 两组miR-451a与MMP-9表达水平比较 与对照组比较，研究组miR-451a表达水平显著降低，而血清MMP-9表达水平显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组miR-451a与MMP-9表达水平比较(±s)

2.2 不同NYHA分级miR-451a、MMP-9表达情况 不同NYHA分级miR-451a和MMP-9表达水平不同，随着NYHA分级的进展，miR-451a表达下降，而MMP-9表达水平上升，不同NYHA分级间miR-451a、MMP-9差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1、图2。

图1 不同NYHA分级miR-451a表达水平

图2 不同NYHA分级MMP-9表达水平

2.3 血清miR-451a与MMP-9表达水平的相关性 线性相关分析发现，随着miR-451a表达水平的降低，MMP-9表达水平逐渐增加，miR-451a与MMP-9的表达水平呈负相关(r=-0.702，P<0.05)。详见图3。

图3 血清miR-451a与MMP-9表达的直线相关分析图

3 讨 论

慢性心力衰竭作为各种心血管疾病最严重的阶段，其发病率及死亡率极高，且近年来其发病率持续增长。在国外人群中心力衰竭的患病率为1.5%～2.0%，在我国人群中患病率为0.9%[6]。慢性心力衰竭是一种进行性病变过程，其发生的基本机制是心肌重塑。病理性心肌细胞肥大、心肌细胞凋亡、心肌细胞外基质过度纤维化或过度降解等都是心肌重塑过程的典型特征。

MMPs被认为是细胞外基质周围的标志物，可以降解大量的锌依赖性蛋白质，从而降解广谱的细胞外基质蛋白质，包括胶原蛋白[7]。在肿瘤血管生成、转移和血管内膜增生等组织重塑过程中均观察到MMPs表达的增加。心肌重塑过程是胶原蛋白、糖蛋白等大分子物质参与的复杂过程，在维持心脏正常结构和功能中起重要作用。已有研究报道，MMPs及其内源性组织抑制剂(TIMPs)在介导心肌纤维化和心肌重塑过程中起重要的调节作用，MMPs和TIMPs的循环水平是心肌重塑和心力衰竭的潜在生物标志物[8-9]。在转基因小鼠和充血性心力衰竭动物模型中观察到MMP-2和MMP-9活性与左心室重塑相关[10-12]。而MMP-9基因的靶向缺失可抑制急性和左心室压力超负荷心力衰竭小鼠模型中的心肌重塑[13-14]。在小鼠慢性心力衰竭模型中发现，心脏功能受损与内皮细胞和心肌细胞凋亡有关，MMP-9的活化在与内皮细胞和心肌细胞凋亡相关的心室重塑中起主要作用[15]。另有研究表明，心力衰竭病人心肌组织蛋白表达水平高于正常人，且随着心功能恶化，MMP-9含量逐渐升高[16]。动物研究发现，心力衰竭造模兔血清MMP-9浓度高于假手术组[17]。本研究发现，慢性心力衰竭病人血清MMP-9水平高于健康对照组，且不同NYHA分级的慢性心力衰竭病人MMP-9表达水平不同，随着心力衰竭程度的增加及病情的进展，MMP-9表达水平呈上升趋势，提示MMP-9在慢性心力衰竭的发生发展及病情演变过程中起着重要作用。

miRNA是长21-25nt的非编码RNA分子，其通过靶向结合mRNA的3′非翻译区(3′UTR)来抑制转录和转录后水平的基因表达。miRNA可结合mRNA的部分互补识别序列，随后引起mRNA降解可翻译抑制，从而有效沉默其靶基因[18-20]。生物信息学研究表明，三分之一的已知基因可能被miRNA调控。许多研究已报道miRNA参与许多重要的细胞过程，如细胞凋亡、分化、增殖、肿瘤发生及抑制等[21]。已有研究证明，多种miRNA参与心力衰竭的发生发展过程，并参与调控心肌肥大、心肌凋亡、心肌纤维化等过程。病理性心肌肥大通过影响心脏舒缩功能而引起心功能障碍，是发生心力衰竭的原因之一。有研究发现，miR-208能够降低甲状腺激素相关蛋白1和肌肉生长抑制因子的表达，从而促进心肌生长，引起心肌肥大[22]。另有研究表明，miR-1可通过抑制心肌细胞增强因子2和心肌转录因子4的表达，并通过调控钙-钙调蛋白信号通路调节心肌细胞生长，从而抑制心肌肥大[23]。miR-133a通过直接与活化T细胞核因子c4的3′-UTR结合，使其表达下调而抑制心肌肥大[24]。体内和体外研究表明，miR-1和miR-206通过协同作用共同调节MAPK信号通路调节与细胞凋亡相关的热休克蛋白HSP的表达，从而加速心肌细胞凋亡过程[25]。而miR-133通过抑制半胱氨酸-天冬氨酸蛋白消解酶9的表达，从而起抗凋亡作用，与miR-1通过相互拮抗调节心肌细胞凋亡[26]。心肌纤维化也是引起心力衰竭的原因之一，其主要是由于成纤细胞增生和心肌间质纤维化会使心肌结构及功能发生紊乱，并最终导致心力衰竭。研究表明，心力衰竭时miR-21过表达，通过抑制ERK/MAPK信号通路活性而调节心肌纤维化，从而改善心脏功能[27]。另外，miR-133和miR-30通过直接与调控纤维化过程的结缔组织生长因子CTGF的3′-UTR结合，下调其表达水平，从而抑制胶原纤维生成[28]。且临床研究表明，miR-133的两个表型miR-133a和miR-133b在心脏的心肌细胞中特异性表达，且在慢性心力衰竭病人血清中的表达水平升高，可能通过调节作为心力衰竭独立预测指标的NT-proBNP水平而参与心肌重塑和心脏功能，且随着病情进展，其表达量逐渐升高[29]。人miR-451a基因位于染色体17q11.2内，已有研究表明miR-451可作为多种癌症如鼻咽癌、肝细胞癌、膀胱癌等癌症中的肿瘤抑制因子，且在糖尿病肾病病变中通过调节LMP7/NF-κB信号通路影响膜细胞因子的表达，从而缓解肾纤维化过程。本研究发现，与健康者相比，慢性心力衰竭病人血清miR-451a表达水平显著降低，且随着心力衰竭程度的增加，其表达水平逐渐降低。提示miR-451参与慢性心力衰竭的发生发展及病情演变过程。

MMP-9表达水平可以在转录前和转录后进行调节。研究证明MMP-9受到多种miRNA调节而参与多种疾病的发生、发展过程。如miR-145通过调节MMP-9表达水平而抑制胃癌转移。在大肠癌细胞中，miR-21通过在转录后水平调控PTEN/AKT/PI3K/mTOR信号通路活化而改变MMP-9的表达，从而抑制癌细胞的迁移和浸润[30]。在动脉粥样硬化性脑梗死中，MMP-9单核苷酸多态性受miR-491介导的多态调控机制的精细调节作用，而导致MMP-9表达水平发生变化。有研究表明，2型糖尿病模型大鼠心肌组织中miR-29b表达水平的上调抑制了MMP-9的表达，从而减少心肌纤维化[31]。另外，在非瓣膜性心房颤动病人中，miR-29b与MMP-9表达呈负相关，参与心房颤动病人心肌重塑的病理过程[32]。MMP-9是TargetScan预测的miR-451a靶基因之一。本研究对miR-451a与MMP-9的表达水平进行线性相关分析发现，随着miR-451a表达水平的降低，MMP-9表达水平逐渐增加，慢性心力衰竭病人血清miR-451a与MMP-9的表达呈负相关。提示miR-451a与MMP-9可能具有负向反馈抑制作用，miR-451a至少部分通过调控MMP-9表达而在慢性心力衰竭的发生发展及病情演变过程中起作用。

综上所述，慢性心力衰竭病人血清miR-451a水平显著降低，而MMP-9水平显著升高，不同NYHA分级慢性心力衰竭病人MMP-9和miR-451a的表达水平差异均有统计学意义，随着心力衰竭程度的增加，血清miR-451表达水平逐渐下降，而MMP-9表达水平逐渐上升，二者存在明显负相关性，提示miR-451a至少部分通过调控MMP-9表达而在慢性心力衰竭的发生发展及病情演变过程中起作用。而慢性心力衰竭过程中miR-451a对MMP-9调控作用的分子机制及所涉及的信号通路尚不明确，需要更多研究来进一步证实。