头似辐首线虫的形态观察及rDNA-ITS序列分析

胡丽莉，孙 彦，张 悦，卜艳珍

(河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007)

头似辐首线虫(Gyalocephaluscapitatus)隶属于圆线科(Strongylidae)盅口亚科(Cyathostominae)辐首属(Gyalocephalus)，是寄生于马属动物(马、驴、骡等)结肠和盲肠内的小型圆线虫[1-3]。该线虫呈世界性分布，在亚洲、非洲、美洲、欧洲等地均有报道[2-5]，在我国主要分布于四川、云南、青海、内蒙、宁夏、新疆等地区[4,6]。宿主被感染后，会出现精神萎靡、食欲不振、消瘦、贫血、四肢瘫软等症状，严重时可导致死亡，给畜牧业养殖造成较大的经济损失。为了有效诊断、预防和控制寄生虫病，首先要对寄生虫进行准确的鉴定和分类。线虫分类鉴定的主要依据是形态学特征，但是对于虫卵、不同发育时期的幼虫以及一些形态极为相似的虫体却比较困难，因此，形态学鉴定方法尚有一定的局限性。

随着分子生物学的发展，分子标记技术已被广泛运用于生物的分类系统中，目前常用的分子标记有核糖体DNA内部转录间隔区(rDNA-ITS)、16S核糖体RNA基因(16S rRNA)、18S核糖体RNA基因(18S rRNA)和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA-COⅠ)基因等[7-8]。其中rDNA-ITS具有种内变异小而种间变异大的特征，因此，是寄生虫分类鉴定的有效遗传标记[9-13]。运用rDNA-ITS序列对寄生虫进行分类、鉴定及遗传多样性分析已成为研究的热点。迄今为止，国内外学者对头似辐首线虫的研究仅限于传统的形态学观察和流行病学调查[2-3,5]，而关于分子生物学方面的研究尚未见报道。本研究拟采用形态与分子相结合的手段对头似辐首线虫的分类地位进行准确界定和分析，以期为今后线虫的有关研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 研究所用的2条(雌雄各1条)头似辐首线虫采自马肠道，用生理盐水反复冲洗后，于700 mL/L乙醇中固定保存。标本存放于河南师范大学生命科学学院。

1.1.2 主要试剂和仪器 蛋白酶K、UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，Solarbio公司产品；2×TaqDNA聚合酶、DNA Marker DL 1000，大连宝生物工程公司产品；其他试剂均为国产分析纯；数码生物显微镜，OLYMPUS公司产品；PCR仪，德国Biometra公司产品；电泳仪，北京市八一仪器厂产品；凝胶成像系统，上海天能科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 形态学观察 将固定保存的虫体置于载玻片上，先用乳酸苯酚溶液(2份甘油、1份苯酚饱和溶液、1份乳酸、1份水)透明，然后在数码生物显微镜下进行观察、测量和拍照。

1.2.2 DNA提取 取一条虫体于双蒸水中漂洗，每隔20 min～30 min换一次水，持续2 h～3 h。然后将头和尾剪掉重新放回固定液中，以便与序列结果进行比对。虫体剩余部分置于一个1.5 mL的离心管中，用灭菌的剪刀将虫体剪碎，加入消化液(含蛋白酶K)后置于37℃恒温水浴锅中消化过夜。消化好的悬液采用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，于-20℃保存。

1.2.3 PCR扩增与纯化 用一对保守引物扩增rDNA-ITS(包括ITS1、5.8S和ITS2)片段：NC5(上游)5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′和NC2(下游)5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。引物由苏州金维智生物技术有限公司合成。

PCR扩增体系25 μL,包括2×TaqMaster Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL。rDNA-ITS的PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 45 s，56℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35个循环，最后72℃延伸7 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，于紫外透射仪中观察拍照。然后在紫外灯下将含有清晰、单一目的条带的胶块切下，分别放置于标记好的1.5 mL离心管中，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的条带进行纯化回收。

1.2.4 序列测定分析与系统树的构建 将纯化后的PCR产物送往英潍捷基(北京)贸易有限公司进行双向测序。测出的序列先用Chromas软件查看测序结果峰图，再用ClustalX1.83和MEGA 5.0软件对序列进行比对分析。序列提交至GenBank数据库，获得序列注册号。用MEGA 5.0软件，采用最大似然法ML(Maximum likelihood)，以有齿食道口线虫(Oesophagostomumdentatum)为外群，对圆线科的16种线虫构建系统发育树，以探讨线虫间的亲缘关系。

2 结果

2.1 虫体的形态特征

虫体中等大小。口领显著，头部顶面观呈圆形。口领的后缘位于口囊前缘之后。口领顶端两侧各有1个头感器，头感器小，稍微隆起。2个头感器之间对称排列着4个亚中乳突，乳突相对较小，顶端尖，呈圆锥形。口孔小，近似圆形。口孔周围有2圈叶冠，外叶冠由口内向外突出，内叶冠分布在口囊的内缘。外叶冠数目较多，约90个～95个小叶；内叶冠比外叶冠长而宽，数目少，约30个～40个小叶。口囊短而宽，囊壁厚，前宽后窄。背沟不显著，口囊内无齿。食道前端膨大，呈漏斗状。在食道漏斗基部有6个半月形、放射状排列的间隔，以齿状突起深入口囊内，每个间隔的基部有1个小齿。神经环位于食道中部稍后(图1A-图1C)。

雄虫(n=1)：体长8.950 mm，最大体宽0.350 mm。口领高0.031 mm，口领与体部交界处宽0.191 mm。口囊内径深0.042 mm，内径宽0.113 mm，口囊壁前端厚0.021 mm，后端厚0.012 mm。食道长0.960 mm。食道漏斗深0.096 mm，宽0.125 mm。神经环距头端0.410 mm；颈乳突距头端0.520 mm。雄虫尾部具有发达的交合伞，由1个背叶和2个卵圆形的侧叶组成，背叶和侧叶分界不明显。交合伞自外背肋基部至背肋末端的长度为0.480 mm。交合刺1对，等长，长1.250 mm。引器长0.190 mm。生殖锥较长呈圆锥形，延伸超过交合伞侧叶。生殖锥上分布着1对指形附属物(图1D)。

雌虫(n=1)：体长10.230 mm，最大体宽0.490 mm。口领高0.037 mm，口领与体部交界处宽0.205 mm。口囊内径深0.047 mm，内径宽0.128 mm，口囊壁前端厚0.024 mm，后端厚0.013 mm。食道长1.150 mm。食道漏斗深0.112 mm，宽0.148 mm。神经环距头端0.500 mm；颈乳突距头端0.620 mm；雌虫尾部细长，尾尖呈圆锥形。阴道长0.192 mm，阴门与肛门距离较远，阴门距尾端0.670 mm，肛门距尾端0.290 mm(图1E-图1F)。

2.2 ITS序列分析

将测序结果提交至GenBank数据库，获得登录号为KP693442。ITS序列总长867 bp，其中ITS1长380 bp，5.8S长153 bp，ITS2长334 bp；ITS1区的G+C含量(46.6%)高于ITS2区(42.0%)(图2)。在GenBank中经过Blast搜索，未发现头似辐首线虫的相关序列。与所测序列同源性最高的是盅口亚科的冠状冠环线虫(Coronocycluscoronatus)(登录号：JN786950)，为92%，其次是辐射杯环线虫(Cylicocyclusradiatus)(登录号：JQ906424)、双冠双冠线虫(Cylicodontophorusbicoronatus)(登录号：KP693441)、细口杯环线虫(Cylicocyclusleptostomus)(登录号：KP693432)，同源性均为89%。而与圆线亚科的伊氏双齿口线虫(Bidentostomumivaschkini)(登录号：KP693440)和日本三齿线虫(Triodontophorusnipponicus)(登录号：KP693437)的同源性为86%，与短尾三齿线虫(Triodontophorusbrevicauda)(登录号：KP693436)和锯齿状三齿线虫(Triodontophorusserratus)(登录号：KR296738)的同源性为85%。

A.头端侧面观；B～C.虫体前端侧面观；D.雄虫尾端侧面观(箭头示生殖锥)；E～F.雌虫尾端侧面观(箭头示阴门和肛门)。图中比例尺：A=0.1 mm；B～F=0.2 mm

A.Anterior end,lateral view; B-C.Anterior part of body,lateral view; D.Male tail,lateral view (arrow showing genital cone); E-F.Female tail,lateral view,(arrow showing vulva and anus).Scale-bars:A=0.1 mm; B-F=0.2 mm

图1头似辐首线虫光镜图谱

Fig.1 Light microscopic graphs ofGyalocephaluscapitatus

图2 头似辐首线虫的ITS序列

2.3 系统发育分析

用MEGA 5.0软件，以有齿食道口线虫为外群，将本研究虫种与11条盅口亚科和4条圆线亚科线虫的ITS序列，应用最大似然法ML构建系统发育树(图3)。分析结果显示，内群共形成2个大支：头似辐首线虫与11种盅口亚科线虫聚为一支；4种圆线亚科线虫聚为另一支。盅口亚科又分为2个小支：头似辐首线虫与杯环属、盅口属、冠环属和双冠属聚在一起；副杯口属和杯口属聚在了一起。由此可知，头似辐首线虫与盅口亚科线虫的亲缘关系较近。

3 讨论

Looss A[14]首次在马肠道内发现头似辐首线虫，并建立了辐首属(GyalocephalusLooss，1900)。Yamaguti S[15]在他的分类系统中将辐首属归入盅口族(Cyathostominea Nicoll，1927)。1986年，德国学者Hartwich G[16]基于辐首属线虫的头部以及食道漏斗等结构特征，将其从盅口族移出，放入辐首族(Gyalocephalea Popova，1952)。随后在Lichtenfels J R[17]提出的分类系统中也承认Hartwich G的观点。但是，一些学者认为，辐首属线虫与盅口族内其他成员的许多结构特征相似性非常大，因此仍将其放入盅口族[2-4]。本研究首次对采自马肠道内的头似辐首线虫进行观察和描述，所采标本的形态特征与张路平和孔繁瑶[3-4]、Lichtenfels J R等[2]的描述基本一致。

图3 基于ITS序列构建的系统发育树

寄生线虫传统的分类鉴定依据是形态学特征，但是对于一些相似种或隐含种却有一定困难[18-19]。随着分子生物学的迅速发展，DNA分子标记技术已逐渐运用于线虫的分类鉴定。本研究首次对头似辐首线虫的rDNA-ITS序列进行测定和分析，经检索，GenBank数据库尚未收录该线虫的相关序列。通过Blast搜索发现，头似辐首线虫与盅口亚科中冠状冠环线虫的同源性最高，达到92%，其次是辐射杯环线虫、双冠双冠线虫和细口杯环线虫，而与圆线亚科线虫的同源性相对较低。由此可知，头似辐首线虫与盅口亚科线虫的关系较近。构建的系统进化树同样显示，头似辐首线虫与盅口亚科线虫聚为一支，而圆线亚科线虫聚为另一支。进一步表明头似辐首线虫与盅口亚科线虫的亲缘关系较近，而与圆线亚科线虫的亲缘关系较远，可见，将辐首属归入盅口亚科是合理的。这一结论与传统形态学分类结果一致[2-4]。本研究进一步确定了头似辐首线虫的分类地位，为今后该线虫的研究奠定了基础。