猪瘟病毒Shimen株侵染猪肺泡巨噬细胞与猪血管内皮细胞的转录组共表达基因分析

龚小程，胡傲雪，李雪鹏，吴中兴，何 骏，郭少敏，宁蓬勃*

(1.西安电子科技大学生命科学技术学院，陕西西安 710071；2.西北农林科技大学校医院，陕西杨凌 712100)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种具有高度传染性和致死性的疾病，严重影响世界养猪业的发展[1]。猪瘟病毒石门株(CSFV Shimen)是经典强毒株，可以逃避宿主免疫监控并建立持续侵染[2]，引起出血性淋巴结炎，皮肤、肾等器官的弥散性出血以及高热、抑郁等发病症状[3]。虽然国内外对CSFV Shimen的侵染机制研究已取得一定进展，其深层次的致病机制仍需深入探究。

以往针对病毒与宿主细胞的互作机制研究工作，常依赖“文献学习”方法来提示可能的互作基因，以致创新能力有限。近年来，高通量测序为基础的组学研究技术，为系统全面地解读CSFV的侵染机制提供了可能。同时，随着测序成本的降低，如何在日益丰富的多组学大数据中有效挖掘关键信息，这对研究者提出了新的思考。

巨噬细胞作为免疫系统的重要组成成分，在非特异性防御、抗原呈递和炎症反应中起着至关重要的作用[4]。血管内皮细胞参与血管多方面的生理功能调节，在急性炎症的情况下，血管内皮细胞渗透性增加可导致组织的水肿或肿胀。巨噬细胞和血管内皮细胞作为猪瘟病毒的主要靶细胞，已为国内外研究者所关注。本课题组前期采用CSFV Shimen分别侵染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)及猪脐静脉血管内皮细胞(swine umbilical vein endothelial cells,SUVEC)，应用高通量测序分析技术分别获得CSFV Shimen侵染PAMs和SUVEC后的转录组学数据库[5-6]。在解读CSFV Shimen对不同宿主细胞形成特异性侵染应答机制的同时，也考虑到CSF作为全身多组织脏器损伤的烈性传染病，CSFV Shimen 对不同宿主细胞的侵染机制也必定存在共性作用机制。这种共性作用机制的发现将更有助于系统阐明CSF内在的发病机制。为此，本研究对已有两种细胞系的差异表达基因进行关联分析，深度挖掘分析CSFV Shimen侵染PAMs及SUVEC后宿主共性的关键应答基因，研究结果可为CSFV与宿主细胞之间的分子相互作用研究提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

CSFV Shimen，兽医生物制品和药物控制研究所产品(中国北京)，PAMs 3D4/21(CRL-2843)，美国典型培养物保藏中心产品(Manassas,VA,USA)[7]，SUVEC取自猪脐带静脉，构建的传代细胞系[6]。

1.2 方法

1.2.1 关联分析 CSFV Shimen侵染以及Mock对照的PAMs和SUVEC提取RNA并完成高通量测序，采用数字基因表达谱技术，获得CSFV Shimen侵染条件下，PAMs和SUVEC以及对照组在转录水平差异表达的基因[5-6]。在本研究中，我们将PAMs与SUVEC的转录组学数据库中错误发现率(False discovery rate，FDR)≤0.001且倍数差异在2倍及以上的基因定义为差异表达基因；将两数据库中共同表达的基因相关联；遴选共同上调或共同下调表达的差异基因作为研究目标，以更准确解读CSFV Shimen侵染的典型机制。

1.2.2 生物信息学分析 Gene ontology(GO)是在生物信息学中对基因和蛋白质的功能进行限定和描述的分析工具，涵盖细胞组分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物过程(biological process,BP)三个方面。通过DAVID对差异表达基因进行GO富集分析，其中P<0.05的GO术语被认为是显著性富集。KEGG是在分子水平解读基因或蛋白质之间交互(互动)网络的网络数据库，同样通过DAVID对差异表达基因进行KEGG富集分析，其中P<0.05的KEGG术语被认为是显著性富集。

1.2.3 统计学分析 使用SPSS 13.0(SPSS，Chicago，IL)软件进行统计分析。错误发现率(FDR)被控制在0.001以下的认为其具有显著性意义，并且通过t检验来检查平均值之间的差异。当P<0.05时被认为是具有显着性意义。

2 结果

2.1 PAMs与SUVEC的转录组学数据库共同表达的差异基因

将CSFV Shimen侵染PAMs后得到的显著差异表达基因2649个，以及侵染SUVEC得到的显著差异基因658个，分别进行聚类分析。其中PAMs数据库中得到上调基因1303个，下调基因1346个；SUVEC数据库中得到上调基因262个，下调基因396个。进一步将两组数据分别关联，对得到的两组上调基因及两组下调基因分别取其交集，最终得到两种细胞系共有的同趋势差异表达基因，其中共同上调基因有39个，共同下调的基因有77个(图1)。表1结果提示，与宿主细胞生命活动密切相关的部分基因，例如：真核翻译起始因子4A3(EIF4A3)、蛋白酶体β亚基3型(PSMB3)、谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2(GOT2)、微管相关蛋白1A/1B轻链3A(MAP1LC3A)、磷脂酶D3(PLD3)、ATP依赖性染色质重塑剂SMARCA4(SMARCA4)、蛋白酶体α亚基6型(PSMA6)、CDC28蛋白激酶调节亚基1B(CKS1B)、泛素缀合酶E2变体1(UBE2V1)，在两组数据库中出现了共同下调，而酪氨酸蛋白磷酸酶非受体2型(PTPN2)、内质网-高尔基中间隔蛋白2(ERGIC2)等基因则出现了共同上调表达。

上面2个代表了SUVEC和PAMs上调的基因，下面2个代表了两种细胞下调的基因

Top two represent up-regulated genes in vascular endothelial cells and macrophages,respectively.Two down represent down-regulated genes in both cells

图1 CSFV Shimen侵染PAMs与SUVEC
中差异表达基因数量

Fig.1 Coexpression analysis of macrophages and endothelial
cells infected with CSFV Shimen

2.2 GO与KEGG分析

为了探明与CSFV Shimen侵染相关基因表达变化的可能结果，基于GO数据库对侵染了CSFV的PAMs和SUVEC具有相同变化趋势的差异基因进行了GO分析。结果显示,CSFV Shimen侵染在分子功能和细胞组分变化相关的系列生物过程中引起了PAMs基因的异常表达。如图2所示，CSFV Shimen侵染不仅可以影响细胞的翻译起始过程、核转录的mRNA分解过程，影响琥珀酸代谢过程以及神经系统的发育等等。同时，还发现这些差异基因大多数被富集在了与NF-κB有关的信号通路中，提示了CSFV Shimen感染过程中炎性发展机制的关键所在。

为了进一步阐明与CSFV Shimen侵染相关的差异表达基因的功能作用，基于KEGG数据库同样针对侵染了CSFV的PAMs和SUVEC具有相同变化趋势的差异基因进行了KEGG分析(图3)。显著性的KEGG通路包含抗生素的生物合成、RNA运输、DNA复制、蛋白酶体、碳代谢等通路。这些通路与细胞生长、增殖、生物合成及代谢息息相关，提示了CSFV Shimen与宿主细胞相互作用以维持感染稳态的关键机制。

表1 CSFV Shimen侵染后PAMs与SUVEC共表达的同趋势关键基因

不同的颜色代表富集在生物过程中的不同GO术语，扇形区域的大小代表了富集在相应术语中的基因数目所占比例的大小

Different colors represent different GO terms enriched in biological processes,and the size of the fan-shaped region represents the proportion of genes enriched in the corresponding terms

图2共表达差异表达基因的GOBP富集分析

Fig.2 GO-BP enrichment analysis of co-expressing differentially expressed genes

横坐标为P值的负对数，纵坐标为KEGG通路名称

The abscissa is the negative logarithm of the P value and the ordinate is the KEGG pathway name

图3共表达差异基因的pathway富集分析

Fig.3 Pathway enrichment analysis of co-expression
of differential genes

3 讨论

猪瘟是猪最严重和易感染的疾病之一，对全球畜牧业产生了非常严重的影响，其发病机制是仍是当前研究的热点。应用基因芯片技术，Gladue DP等人在CSFV Brescia 侵染48 h后的巨噬细胞中辨明48个上调及31个下调基因，以理解其免疫应答机制；Li J等人对CSFV Shimen感染后获得的单核细胞进行检测分析，获得了免疫、凋亡、周期等相关的系列基因[8]。这些研究虽已尝试在组学层面解读CSF发病机制，但前期研究仅针对单一细胞系进行分析，不利于系统阐明整体发病机制。

本研究中基于高通量测序结果[5-6]开展双细胞组学关联分析，为挖掘宿主与病毒互作的调控基因提供了新思路。s本研究发现(表1)，PSMB3、PSMA6作为显著下调蛋白出现在关联数据组中。PSM是泛素-蛋白酶体系统(UPS)的重要组成元件[9]，而UPS参与细胞的生长、分化、及免疫反应等重要生理过程，动脉粥样硬化、帕金森综合症、癌症等某些重大疾病的内在联系即是UPS功能紊乱。CSF作为病毒性疾病，UPS功能紊乱有可能是其内在病因之一。CKS1的代谢可减慢细胞周期G1期的进程，是乳腺癌病程中的关键因子；而PTPN2能调节干扰素诱导细胞凋亡[10]，CSFV有可能会对宿主细胞的周期及凋亡产生影响，从而为自身复制提供时间及空间。与此同时，PLD3参与神经发生的后期阶段，促成与神经传递、靶细胞神经支配和神经元存活等关键进程，该类基因的下调表达提示了猪瘟病程中精神沉郁等病理性神经症状的可能发生机制。

基于对双细胞系共表达差异基因的GO分析，我们对CSFV Shimen的侵染机制有了更明确的理解。GO分析显示共表达基因主要富集在NF-κB相关的通路中(图2)。NF-κB不仅在调节病毒侵染引起的免疫应答过程中起着至关重要的作用，而且在病毒持续感染中，持续激活NF-κB可致宿主细胞发生致癌转化。HIV-1的复制依赖NF-κB介导[11]，HIV-1糖蛋白gp41与其细胞质结构域结合通过TGF-β诱导NF-κB激活[12]，NF-κB则刺激HIV-1启动子的转录从而促进病毒复制。研究显示，低NF-κB活性的细胞对流感病毒侵染具有抗性，但是在NF-κB活化后却变得敏感，这也提示能够通过阻断NF-κB的激活来抑制流感病毒侵染。丙型肝炎病毒可通过NF-κB/miR-503/bcl-2通路来阻断细胞凋亡[13]。更重要的是，Ling S等[14]发现，猪瘟病毒NS5A蛋白能够与Hsp27细胞相互作用并通过NF-κB信号通路对病毒复制进行负调节。以上研究明确了NF-κB及其相关通路与病毒侵染的关系，有力地支持了我们的分析结果。

大多数病毒如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒等的侵染均能对细胞内DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的生物合成等生物学过程产生一定影响[15]，KEGG的结果同样验证了猪瘟病毒的侵染能够通过改变生物合成代谢，从而为自身的复制与传播提供可能。

综上所述，我们系统比较了CSFV Shimen侵染PAMs和猪血管内皮细胞系中共表达差异基因，并通过生物信息学方法解读了CSFV Shimen侵染的共性调控关系。这些数据为理解CSFV Shimen侵染宿主细胞最终导致猪瘟形成提供了新的视角，为继续深入研究发病机制提供了有价值的科学信息。