不同免疫程序接种PRRS疫苗对仔猪血清抗体水平的影响

丁尊俄，赵双成，张双翔，周碧君*，肖焕星，欧伟业，王开功，秦文学，刘 昱，胡兴义，张 海，李如举，陈 勇

(1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳 550025；3.上海海利生物技术股份有限公司，上海 201403；4.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550001；5.贵州瑞特新科农牧科技有限公司，贵州贵阳550001；6.贵州省凯里市宏大牧业发展有限公司，贵州凯里 556000)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的以怀孕母猪繁殖障碍以及各年龄段猪呼吸道疾病为主要特征的一种传染病[1-2]。因其病毒高度的变异，常有新毒株出现[3-4]，是PRRS免疫防控失败的重要制约因素之一。据大量文献显示，我国约90%的猪场仍持续存在PRRSV，并且部分猪场中还同时存在高致病性毒株、经典毒株等多种流行毒株[5,10]。PRRSV感染猪易导致免疫抑制和受环境影响，还常与其他病原，如与猪瘟病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型等混合感染或多重感染。

疫苗免疫是目前防控该病的首选手段，由于我国商品化的PRRSV疫苗类型多样，免疫效果参差不齐，普遍存在免疫保护空白期及交叉保护率低等缺点[6]。在实际生产中，选择适合猪群的PRRSV疫苗、合理的免疫程序及免疫后对猪只抗体水平的监测成为亟待解决的问题。免疫效果评估是有效防控PRRS的重要环节，选择合适的检测方法尤为重要。ELISA方法具有操作简单、快速高效、适合大规模检测等优点，其中比较认可的主要是针对病毒N蛋白的ELISA试剂盒(N-ELISA)和针对病毒GP和M蛋白的ELISA试剂盒(G-ELISA)[7]。本研究于规模化猪场选取具有PRRSV双阴性仔猪，按照不同免疫程序，不同疫苗类型及组合对其进行免疫接种，采用上述两种ELISA试剂盒检测PRRSV特异性抗体，以期客观评价疫苗联用的临床免疫效果，为养猪生产实际中有效防控PRRS提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用猪 12 d～14 d未免疫的哺乳仔猪40头，其品种为“杜+长+大”三元杂交猪，均由贵州省凯里市宏大牧业发展有限责任公司提供，该猪场为农业部认定的生猪标准化示范场，有很好的饲养管理及生物安全防范措施。上述仔猪及其母猪经ELISA和实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测PRRSV均为阴性，同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)均为阴性。

1.1.2 疫苗及主要试剂 PRRSV弱毒疫苗(CH-1R株)，10头份/瓶；PRRSV灭活疫苗(NVDC-JXA1株)，100 mL/瓶，均由上海海利生物技术股份有限公司提供。PRRSV通用型荧光RT-PCR检测试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品；PRRSV ELISA抗体检测试剂盒(由N蛋白包被)为IDEXX公司产品；PRRSV ELISA 抗体检测试剂盒(由GP和M蛋白包被)为LSI公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验猪分组及疫苗免疫 将试验仔猪随机分成4组，每组10头，于免疫前(记为0 d)， 免疫接种后7、14、21、28、35、42、49、56、63 d前腔静脉采血约5 mL，分离血清置于-20℃冰箱保存备用，试验猪免疫程序见表1。

表1 试验猪免疫程序表

1.2.2 检测方法 分别用N-ELISA和G-ELISA试剂盒检测，具体操作过程参照各试剂盒说明书进行。 N-ELISA抗体水平用S/P值表示，S/P=(样品OD650值-阴性对照OD650平均值)/(阳性对照OD650平均值-阴性对照OD650平均值)；G-ELISA抗体免疫水平用IRPC值表示，IRPC=[(样品OD450-阴性对照平均值OD450)/(阳性对照平均值OD450-阴性对照平均值OD450)]×100。判定标准：PRRSV S/P值≥0.40即为抗体阳性，IRPC值>20.0即为抗体阳性。

1.2.3 统计分析 检测数据用Excel 2013和SPSS 17.0软件进行统计及处理。

2 结果

2.1 仔猪免疫后PRRSV N-ELISA抗体水平检测结果

对仔猪免疫接种后，采用PRRSV N-ELISA试剂盒检测不同时间内的抗体变化情况。各试验组血清PRRSV抗体水平检测结果见图1、图2。由图1可知，在仔猪首免后21 d时，A、B、C、D 4个组阳性率分别为70%、70%、80%、0；仔猪二次免疫后28 d、56 d，A、B、C、D 4个组阳性率分别为100%、100%、90%、0；35 d、42 d、49 d、63 d，A、B、C、D 4个组阳性率分别为100%、100%、80%、0；由图2各试验组抗体平均水平分析可知，A、B两组在首免后35 d抗体S/P平均值最大，分为2.311和2.466 ，C组在首免后28 d抗体S/P平均值最大，为2.147 ；在首免后35 d、42 d、49 d、56 d、63 d A、B两组与C、D两组抗体S/P平均值差异极显著(P<0.01)且C、D两组差异极显著(P<0.01)，但A、B两组差异不显著(P>0.05)。说明接种两次经典弱毒疫苗或首免经典弱毒疫苗二免高致病性灭活疫苗联合使用的效果优于只免疫接种一次的效果。

图1 仔猪免疫后血清PRRSV N-ELISA抗体阳性率

2.2 仔猪免疫后PRRSV G-ELISA抗体水平检测结果

对仔猪免疫接种后，采用PRRSV G-ELISA试剂盒检测不同时间内的抗体变化情况。各试验组血清PRRSV抗体水平检测结果见图3和图4。由图3可知，仔猪免疫接种后21 d时，A、B、C、D 4个组阳性率分别为10%、0、10%、0；28 d时，A、B、C、D 4个组阳性率分别为20%、30%、20%、0；35 d时，A、B、C、D 4个组阳性率分别为80%、50%、70%、0；42 d、49 d，A、B、C、D 4个组阳性率分别为100%、90%、100%、0；56 d、63 d，A、B、C、D 4个组阳性率分别为100%、100%、100%、0；由图4各试验组抗体平均水平分析可知，在首免后21 d A、B、C 3个组在疫苗免疫后抗体IRPC平均值均呈现上升趋势，在28 d～63 d，A、B、C 3个组与D组抗体IRPC平均值差异极显著(P<0.01)，35 d A、C两组与B组抗体IRPC平均值差异显著(P<0.05)，56 d A、B两组与C组差异极显著(P<0.01)且A、B两组差异显著(P<0.05)，63 d A、B两组IRPC平均值差异显著(P<0.05)。

图2 仔猪免疫后血清PRRSV N-ELISA抗体检测结果

图3 仔猪免疫后血清PRRSV G-ELISA抗体阳性率

图4 仔猪免疫后血清PRRSV G-ELISA抗体检测结果

3 讨论

PRRSV主要引起种猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病，临床上表现复杂多样，母猪主要是发情不典型、受孕率低下、流产、木乃伊胎，弱仔、死胎等症状。仔猪主要是咳嗽、喘气、生长缓慢、死亡率增加等症状。2006年，我国猪群中暴发了以猪的体温升高、呼吸障碍、高发病率和死亡率为特征的HP-PRRS，给我国养猪业带来了灾难性损失[8-9]。近几年来该病主要呈地方性流行，由于PRRSV感染可以引起免疫抑制和持续性感染，给PRRS的防控带来极大困难，因此，制定科学的免疫计划是有效防控PRRS的重要措施。目前商品化的PRRS疫苗主要有7个毒株的弱毒疫苗和3个毒株的灭活疫苗[10]，但大多数养殖场只单一使用其中一种疫苗来预防本病的发生。据文献报道，弱毒疫苗与灭活疫苗联合使用效果更佳[11-12]。本研究正是基于此，以期找到能更好预防猪场PRRS的方法。

在猪群感染PRRSV野毒或接种疫苗后，会产生一系列针对不同蛋白的抗体。N蛋白作为PRRSV的核蛋白，免疫原性强，感染猪主要产生的是针对N蛋白的抗体[13]。而N蛋白在病毒结构内部其产生的抗体不具有中和活性，检测N蛋白抗体可以作为PRRSV感染的诊断，但不适合对疫苗免疫效果的检测[14]。有研究表明，具有中和活性的抗体主要是针对GP5和GP2、GP3、M等结构蛋白[15-16]。GP和M蛋白与中和抗体具有高度相关性，监测GP和M蛋白抗体可反映保护性抗体水平[17]。本试验结果显示，PRRSV双阴性仔猪首次免疫经典弱毒疫苗后，N-ELISA抗体在14 d可以检测到阳性，而G-ELISA抗体在21 d才检测到抗体阳性，可能与N蛋白诱导抗体产生的时间比GP蛋白早有关，这与Plagemann等人的研究结果基本一致[17]，因此N-ELISA抗体的检测可以作为PRRSV早期感染的诊断，G-ELISA抗体的检测可以间接反映疫苗的免疫保护效果。另外，N-ELISA抗体S/P值表明，免疫接种两次经典弱毒疫苗组或首次免疫经典弱毒疫苗和二次免疫高致病性灭活苗组的抗体水平差异不显著(P>0.05)；G-ELISA抗体IRPC值表明，在免疫接种后35 d、56 d、63 d首次免疫经典弱毒疫苗和二次免疫接种高致病性灭活苗组与免疫接种两次经典弱毒疫苗组差异显著(P<0.05)；且两种ELISA检测结果均表明，免疫接种两次经典弱毒疫苗组或首次免疫接种经典弱毒疫苗和二次免疫接种高致病性灭活苗组的抗体水平均显著优于只单独免疫接种一次经典弱毒组。

目前猪场PRRSV感染较为复杂，控制难度大，影响我国养猪生产的主要是基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒，主要包括高致病性野毒株、经典毒株、疫苗毒株、类NADC30毒株等，HP-PRRSV毒株仍是我国猪群中的优势流行毒株[18-19]。从理论上讲，对于高致病性野毒感染猪场采用同源性高的HP-PRRS变异毒株弱毒疫苗免疫效果最好，但高致病性PRRS弱毒疫苗本身存在散毒危险和潜在的毒力返强可能性更大[20]。笔者从安全的角度考虑，采用了毒性较低的经典毒株弱毒疫苗结合高致病性变异毒株灭活疫苗组合进行免疫，这样不仅体现抗毒范围广，而且抗体维持时间长，对中大猪保护效果更好。试验结果也得出了首次免疫接种经典弱毒疫苗和二次免疫接种高致病性灭活疫苗能够起很好的保护作用，此结果对于已感染PRRSV的猪场或受PRRSV威胁区的猪场具有重要的参考价值。