铁离子螯合剂抗顺铂诱导豚鼠耳蜗毛细胞氧化损伤及调控Caspase-3表达的实验研究

孙瑶 李彦 司马国旗⋆ 王超 赵慧云 邬万新

自1969年Rosenberg首次报道应用顺铂（DDP）治疗恶性肿瘤，目前已成为治疗恶性肿瘤的主要化学药物，但随着给药剂量的增加，顺铂对机体的毒副作用也随之增强，特别是顺铂所致耳毒性仍是影响该药使用乃至停药的主要因素［1］。文献表明［2］，顺铂耳毒性主要机制在于耳蜗螺旋器抗氧化物质减少、活性降低，最终损害血管纹、毛细胞，细胞内氧自由基活力增加和抗氧化酶类的活性丧失是产生细胞损害的重要因素之一。甲磺酸去铁胺（DFO）是一类高选择性铁离子螯合剂，临床用于治疗输血所致的含铁血黄素沉着病和地中海贫血等急、慢性铁中毒，安全有效，可竞争性地与铁离子形成复合物，减少氧自由基的生成［3］。本文探讨DFO是否能抑制耳蜗细胞凋亡，降低顺铂耳毒性。

1 资料与方法

1.1 实验动物分组及模型的制备 （1）实验动物：选择60只无特定病原体级健康豚鼠（Zmu-1：DHP）（购自浙江大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SOCK（浙）2012-0052），体重 300～350g，随机分成4组。饲养于嘉兴市第一医院实验动物中心无特定病原体级动物室内饲养，室内室温（22～24℃），相对湿度45%～50%，12h昼夜节律。常规颗粒饲料并添加及白菜、胡萝卜等辅食，养殖及实验过程中严格遵守3R原则，适应性饲养1周后，开始用于实验。（2）实验药品及试剂：顺铂（P4394-100MG），美国SIGMA化学试剂公司，批号：MSDS-P4394-0701634；甲磺酸去铁胺（D6533-6G），美国SIGMA化学试剂公司，批号：MSDS-D9533-0701561；T-SOD、GSH-PX、MDA试剂盒，上海索宝生物科技有限公司；一抗：c-JUN兔多克隆抗体，上海沪峰化工有限公司，货号：DOC-071268；JNK兔多克隆抗体，上海沪峰化工有限公司，货号：DOC-075671；Caspase-3兔多克隆抗体，Abcam中国公司生产，货号：AB00026814；二抗：HRP标记羊抗兔抗体，上海沪峰化工有限公司，货号：DOC-072311。（3）实验分组及造模方法：将60只豚鼠按照随机字数表法分为顺铂（DDP）组、顺铂+甲磺酸去铁胺（DDP+DFO）、甲磺酸去铁胺（DFO）组及空白对照组。DDP组及DDP+DFO组采用顺铂腹腔注射法对豚鼠进行耳聋模型诱导，给药剂量为4mg/kg体质量，1次/d，连续给药5d，同时DDP+DFO组豚鼠在每日注射DDP后1h给予腹腔注射DFO 150mg/kg，1次/d，连续给药5d，空白对照组以等量0.9%氯化钠注射液腹腔注射。（4）动物模型分析：①顺铂血药浓度检测：利用电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ICPAES）法［4］对DDP组及DDP+DFO组豚鼠全血进行检测，评估顺铂血药浓度，判断建模成功。②DFO使用安全性检测：应用耳声发射仪（DPOAE）检测DFO组及空白对照组豚鼠测试频率分别为0.5、1、2、4、8kHz处的dB的SPL幅值，判断甲磺酸去铁胺使用安全性。

1.2 标本的功能学、形态学、血清学及分子生物学检测 （1）DPOAE进行功能学检测：用药前1d及停药第2天检测各组豚鼠双耳DPOAE。豚鼠给予1%戊巴比妥30mg/kg腹腔注射麻醉，应用耳声发射仪（Madsen CAPELLA公司）检测双耳500～8000Hz的DPOAE听力图。测试时，清除豚鼠外耳道周围耳毛，清除耵聍，检查外耳道及鼓膜。豚鼠头部固定，将特制耳塞置于外耳道口，使之与外耳道口密封。选择初始纯音f1和f2，使f2/f1=1.22，强度差L1-L2=10dB SPL，DPOAE幅值超过本底噪声3dB以上为检出标准，测试频率f0［f0=（fl×f2）/2］分别为 0.5、l、2、4、8kHz处的 dB SPL幅值。（2）光镜及电镜进行形态学检测：停药后第2天各组动物心脏灌流PBS及固定液（由2.5%戊二醛及4%多聚甲醛按1∶1配制），断头处死后在解剖显微镜下制备标本（摘除镫骨，刺破圆窗，挑开蜗顶）。①光镜观察耳蜗基底膜铺片：将每只豚鼠的左耳听泡再以0.5%硝酸银灌流染色，用蒸馏水冲洗后，置于2.5%戊二醛固定液中固定4h后解剖标本，取出各回基底膜，在光镜下铺片观察。②透射电镜观察基底膜：将每只豚鼠的右耳听泡在2.5%戊二醛固定液中浸泡后及时送镜室，取出基底膜后用PBS缓冲液冲洗，四氧化锇固定，乙醇脱水，环氧树脂浸透包埋，半薄切片染色定位，超薄切片醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜下观察。（3）血清学指标检测：处死豚鼠前取内眦血3ml，3000r/min离心10min，取上层血清，采用脂质过氧化产物MDA、自由基清除物T-SOD及谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX测定试剂盒，按使用说明检测各组标本血清相关指标活力。（4）Caspase-3蛋白表达水平检测：处死豚鼠，取耳蜗组织，采用Westernblot法对各组豚鼠耳蜗中Caspase-3蛋白表达水平进行检测。采用WB及IP细胞裂解液抽提外周血中总蛋白，并测定浓度，加入蛋白上样缓冲液，沸水浴5min变性，调整上样量，使上样总蛋白量为30μg/孔，进行电泳。湿转法将蛋白转印至PVDF膜，一抗（1∶1000），4℃孵育过夜；二抗（1∶2000），37℃孵育2h。充分洗膜后，将PVDF膜置于凝胶成像分析系统中，膜上加ECL工作液2ml，调整曝光时间至60s，采集图像，并采用系统中自带分析软件测定目的条带和内参条带灰度值，以目的条带灰度值/内参条带灰度值的比值作为该样本目的蛋白表达的相对水平进行统计分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料用（±s）表示，采用随机区组t检验，计数资料采用四格表χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型建立 根据顺铂使用量测定顺铂标准液检测值为（2.2±0.28）μg/ml，DDP组及DDP+DFO组豚鼠全血样品中Pt测出值分别为（2.3±0.19）μg/ml及（2.2±0.31）μg/m，相比顺铂标准液，三组间差异无统计学意义（t=1.637，P=0.113），证明动物模型建模成功。

2.2 DPOAE功能学检测 见表1。

表1 各组DPOAE的dB SPL 幅值变化［dB SPL，（±s）］

表1 各组DPOAE的dB SPL 幅值变化［dB SPL，（±s）］

注：三组间两两比较，*P＜0.05

组别 n 0.5kHz 1kHz 2kHz 4kHz 8kHz DFO组 15-0.061±1.23 0.127±1.13 0.5067±1.31 0.401±1.01 0.231±1.17 DDP组 15-0.124±0.97-4.443±1.34-7.34±1.03 -6.079±1.19*-9.979±1.43*DDP+DFO组 15-0.067±1.03-0.641±0.89-2.876±1.26-4.011±1.11*-5.379±0.91*对照组 15-0.058±1.08 0.124±1.21 0.547±1.19 0.394±0.81* 0.257±1.09*

2.3 光镜及电镜形态学检测 （1）光镜检查：对照组及DFO组毛细胞形态完整，毛细胞排列整齐；DDP组毛细胞损伤严重，包括外毛细胞及内毛细胞均出现变型（细胞肿胀）及缺失，从顶回到底回其损伤依次加重，损伤细胞数量依次增加；DDP+DFO组也有不同程度毛细胞损伤，但明显轻于DDP组，但仅限于外毛细胞，第三排外毛细胞可见变型（细胞肿胀）及缺失，第一、二排毛细胞仅见细胞变型，未见细胞缺失，内毛细胞未见损伤。（2）透射电镜检查：对照组及DFO组细胞内的微细结构清晰，内质网、线粒体形态完整，细胞核内染色质分布均匀；DDP组细胞核固缩，染色质浓缩、边集，细胞内胞浆分布不均、空泡形成，细胞器明显减少，胞浆与细胞器形成较多假包涵体，部分可见凋亡小体；DDP+DFO组仅出现细胞内胞浆空泡形成，细胞核内染色质边集，未见凋亡小体，细胞超微结构变性明显轻于DDP组。

2.3 各组血清学各指标活力值 见表2。

表2 各组血清学各指标活力值（±s）

表2 各组血清学各指标活力值（±s）

注：三组间两两比较，*P＜0.05

组别 n MDA（nmol/ml） T-SOD（U/mol） GSH-PX(U)DFO组 15 3.25±0.47 187.34±6.11 591.87±57.23对照组 15 3.01±0.31 192.33±5.78* 586.31±60.21*DDP+DFO组 15 6.51±0.42 129.56±9.31* 387.49±50.31*DDP组 15 9.13±0.56 93.12±6.31* 211.98±34.21*

2.4 分子生物学检测 外周静脉血中，DFO组Caspase-3蛋白表达相比空白对照组稍高，但差异无统计学意义（t=1.813，P=0.063）；在DDP组、DDP+DFO组及空白对照组两两比较中，Caspase-3蛋白表达逐渐降低，组间差异有统计学意义（t=3.078，P=0.0381）。

3 讨论

近年来，由于大量化学药物和抗生素的广泛应用，药物性耳聋的发生率逐年上升，可占全部耳聋的30%～40%。特别是在以铂类制剂为主的肿瘤化疗药物，其耳毒性首先发生在耳蜗毛细胞，多表现双侧对称，以高频听力损失开始，渐向低频扩展，少数人会继续恶化，甚至全聋［5］。药物性耳聋重在预防，国内外相关研究表明，顺铂诱发耳蜗毛细胞氧化损伤的可能机制与其直接抑制组织抗氧化系统及其诱发产生大量自由基有关。动物实验表明，DFO在预防抗生素所致耳毒性方面效果显著，考虑与其减少氧自由基产生，降低氧化损伤有关［6］。

本资料结果，表明DFO的使用在不影响DDP血药浓度的基础上，可改善DDP所致功能学及形态学损伤，有效保护耳蜗毛细胞，减轻DDP耳毒性。有研究显示［7］，顺铂可直接抑制组织的抗氧化系统，使抗氧化酶GSH-PX及 T-SOD的活性下降，催化氧自由基，使生物膜中的不饱和脂肪酸过氧化引起细胞损伤，并因此形成脂质过氧化产物如MDA。本实验也证实了这一结果，DDP组与对照组比较，T-SOD及GSH-PX活力值明显降低，MDA活力值明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。同时在对照组、DDP+DFO组及DDP组比较中，T-SOD及GSH-PX活力值逐渐降低，MDA活力值逐渐升高，组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05），表明DFP可增加DDP豚鼠耳毒性模型中抗氧化酶的活力，降低氧自由基的催化并减少脂质过氧化产物的产生，从而抑制DDP豚鼠耳蜗毛细胞的氧化损伤。

顺铂诱导耳蜗毛细胞氧化损伤后，一方面，受损细胞可释放其细胞膜表面的细胞凋亡受体因子如CD95等，并结合细胞内蛋白接头FADD导致构象改变，形成死亡诱导信号复合物DISC，进而激活Caspase级联反应，诱导耳蜗毛细胞凋亡［8］。另一方面，顺铂DDP抑制组织抗氧化系统后，自由基的催化及脂质过氧化的损伤，可诱导ATF2、c-JUN等转录因子的磷酸化，促进多种促凋亡蛋白的表达，导致细胞凋亡或死亡［9］。在本实验中，DDP组与对照组比较，凋亡因子Caspase-3的表达明显升高，提示顺铂可能通过激活JNK/c-JUN信号通路，进而上调Caspase-3表达水平，使其行成凋亡执行蛋白，导致细胞凋亡。有研究发现［10］，DFO可通过稳定转录因子缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）并诱导其具有保护作用的靶基因表达，阻止氧化应激诱导的细胞凋亡。本实验中DDP+DFO组Caspase-3的表达明显低于DDP组，且在透射电镜下未见凋亡小体，表明DFO有效阻止了氧化应激所导致的细胞凋亡，同时抑制Caspase-3活性及表达，阻断其介导的细胞凋亡通路从而降低细胞凋亡率。