常用调料、酒精饮品和饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴体外作用的实验研究*

张 科 杜 娟 牟 荣** 包怀恩

(1.贵州医科大学基础医学院寄生虫学教研室，贵州贵阳 550025； 2.贵州省教育厅贵州医科大学现代病原生物学特色重点实验室，贵州贵阳 550025)

亚洲带绦虫Taeniaasiatica是近40年来在东南亚和西亚太平洋地区发现的新的带绦虫(包怀恩，2002；包怀恩等，2009；Itoetal., 2015)。亚洲带绦虫的中间宿主是家猪或野猪，感染途径是生食含有活囊尾蚴的猪肝或内脏，成虫寄生于人体肠道并引起亚洲带绦虫病(张科等，2006)。近年来流行病学调查发现亚洲带绦虫感染导致绦虫病的病例报道屡见不鲜(龙昌平等，2014；Kimetal., 2017)，其原因可能与原住民固有饮食习惯，以及对寄生虫致病知识缺乏了解等密切相关。亚洲带绦虫引起的绦虫病已成为一种重要的食源性寄生虫病(包怀恩，2002)。食源性寄生虫病是指通过食用被寄生虫感染或污染的食物而传播的疾病(姜培珍等，2009)，关于亚洲带绦虫，生活史目前已明晰，但是对于影响其幼虫活性的各种化学因素，即烹饪过程中各种调料、佐餐酒精饮品及饮料等对亚洲带绦虫囊尾蚴活性的影响，目前缺乏相关研究及文献报道。近来中国农业科学院兰州兽医所研究团队运用二代测序技术成功解析亚洲带绦虫和牛带绦虫T.saginata基因组，确认了亚洲带绦虫和牛带绦虫极近的进化关系(Wangetal., 2016)，而有国外文献报道T.saginata囊尾蚴在食醋中只能存活5 min，在白酒中却可以存活110 min (Ghebrekidan，1992)，另一篇文献同样报道T.saginata囊尾蚴在食醋中只能存活5 min，在大蒜中可存活10 min，在柠檬汁中可存活40 min (Mohamoudetal.，2003)。这提示牛肉中的囊尾蚴不经过烹饪和高温蒸煮，在餐桌上是相当危险的。因此，本研究在建立亚洲带绦虫囊尾蚴实验感染动物模型的基础上，采用日常生活常用调料、酒精饮品和饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴进行体外实验，研究其囊尾蚴在常用调料、酒精饮品和饮料中存活情况。研究结果将有助于提倡健康饮食，指导人们改变不良饮食习惯，为防治亚洲带绦虫感染导致的食源性寄生虫病提供具有指导意义的基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本: 于贵州省都匀市采用槟榔—南瓜子法对近期有排节片患者驱虫，共采集到4条疑似带绦虫样本，分别命名为都匀1号、都匀2号、都匀3号和都匀4号。虫体以自来水和生理盐水漂洗后置于过滤除菌的生理盐水中4 ℃保存，随后进行形态学观察和测量，并以DNA提取试剂盒提取孕节碎片组织DNA，分别以亚洲带绦虫和牛带绦虫cox1基因片段的特异性引物进行了PCR扩增，综合形态学观察测量和PCR结果，该4条疑似带绦虫样本均鉴定为亚洲带绦虫(杜娟，2012；杜娟等，2013)。

1.1.2实验动物: 本实验使用清洁级4～6周龄雌性昆明小鼠252只，体重18～24 g，购自贵州医科大学实验动物中心，合格证号为SCXK(京)2009-0004。动物实验获得贵州医科大学动物伦理委员会批准。

1.1.3主要试剂: 胃蛋白酶和胰蛋白酶均购自上海源聚生物科技有限公司(货号：E1630和 E2080)；地塞米松注射液购自贵州远康制药股份有限公司。50%猪胆汁为自农贸市场购买猪胆数个，无菌注射器抽出胆汁，按1∶1体积比将胆汁与无菌生理盐水混合后无菌密封，4 ℃保存待用。

1.1.4用于本实验的调料: 食醋(醋酸浓度4.5%，pH3.05)；酱油(含19.3% NaCl)；食盐水：将10 g食盐加入100 mL无菌双蒸水配制得到10%食盐水、将30 g食盐加入100 mL无菌双蒸水配制得到30%食盐水；辣椒水：将10 g辣椒粉加入100 mL无菌双蒸水配制得到10%辣椒水；此外，自农贸市场购买生姜、大蒜和柠檬数斤至数十斤不等，分别洗净晾干切片后放入榨汁机榨取100%生姜汁、100%大蒜汁和100%柠檬汁。上述调料制成后均分别无菌密封，4 ℃保存待用。上述调料均随机购自贵州省贵阳市农贸市场。

1.1.5用于本实验的酒精饮品: 白酒(酒精含量56.00%)；葡萄酒(酒精含量，9.50%～15.00%)；啤酒(酒精含量3.52%～4.80%)。上述酒精饮品均随机购自贵州省贵阳市农贸市场。

1.1.6用于本实验的饮料: 鲜橙多(成分：水、白砂糖、橙浓缩汁、柠檬酸、苹果酸、柠檬酸钠、维生素C、D-异抗坏血酸钠、β-胡萝卜素、阿拉伯胶、食用香精)；营养快线(成分：水、全脂乳粉、白砂糖、浓缩苹果汁、食用增稠剂、稳定剂、食用香精、乙基麦芽酚、阿斯巴甜、安赛蜜、乳酸链球菌素、牛磺酸、维生素E、烟酰胺、维生素B6、维生素A、维生素D、维生素B12)；可乐(成分：水、焦糖、酸橙汁、磷酸等)。上述饮料均随机购自贵州省贵阳市农贸市场。

1.2 方法

1.2.1标本处理: 无菌生理盐水清洗虫体3次，取孕节剪碎，混悬于适量生理盐水中，0.106 mm孔径不锈钢筛网过滤虫卵，生理盐水洗涤虫卵3次后4 ℃保存备用。

1.2.2亚洲带绦虫囊尾蚴实验感染动物模型建立: 参照文献(陈利红等，2005)建立感染动物模型，自感染前30 d开始，每只昆明小鼠每天皮下注射0.4 mg地塞米松，小鼠饲料、饮水和垫料均经高温消毒处理，每周以84消毒液对鼠笼行消毒处理2次。

1.2.3虫卵孵化及六钩蚴计数: 参照文献 (Stevensonetal., 1983) 方法孵化虫卵。取12只试管，每管分别加入亚洲带绦虫虫卵悬液2 mL及1%酸性胃蛋白酶溶液10 mL，加盖后置于37 ℃水浴箱孵化90 min，每隔30 min重悬溶液1次，每次30 s，2 000 r/min离心20 min，弃上清，再分别加入0.05%胰蛋白酶的碳酸氢钠溶液4 mL和50%猪胆汁2 mL，加盖后置于37 ℃水浴箱孵化60 min，每隔10～20 min剧烈重悬1次，每次1 min。同时在显微镜下观察虫卵孵化情况。待约50%虫卵孵出六钩蚴后，将12只试管的孵化液集中于1个离心管内，1 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中再加入无菌生理盐水，1 000 r/min离心10 min，弃上清，如此反复7次，最后收集六钩蚴沉淀备用。六钩蚴沉淀混匀后取100 μL混悬液，加入10 μL 0.4%台盼蓝染色，活六钩蚴不着色，死亡六钩蚴将被染成蓝色，以血细胞计数板计数活六钩蚴含量，混匀后反复计数3次取均值。

1.2.4实验感染: 将活六钩蚴浓度调节至5 000个/mL，每只昆明小鼠皮下注射1 mL该六钩蚴溶液，该日即为感染起始日，于感染后第60 d对小鼠进行剖杀，获取成熟囊尾蚴。

1.2.5常用调料对亚洲带绦虫囊尾蚴死亡率的影响: 将生理盐水、食醋、10%食盐水、30%食盐水、食用酱油、100%生姜汁、100%大蒜汁、10%辣椒水和100%柠檬汁于常温下体外作用于亚洲带绦虫囊尾蚴，上述调料各150 mL分别加入含12个亚洲带绦虫囊尾蚴的培养皿中，培养皿以塑料盖子覆盖防止液体挥发，作用时间分别设定为1、3、5、10、15、25、30和40 min，作用完后将囊尾蚴以清水彻底冲洗3次，再放入含50%猪胆汁的培养皿中37 ℃培养48 h观察头节翻出情况，测定死亡率，同时设立生理盐水处理组为阴性对照组。

1.2.6常用酒精饮品对亚洲带绦虫囊尾蚴死亡率的影响: 将150 mL白酒、啤酒和红酒于常温下分别加入含12个亚洲带绦虫囊尾蚴的培养皿中，培养皿以塑料盖子覆盖防止液体挥发，作用时间分别设定为1、3、5、10、30、60、90和120 min，作用完后将囊尾蚴以清水彻底冲洗3次，再置于50%猪胆汁中37 ℃培养48 h观察头节翻出情况，测定死亡率，同时设立生理盐水处理组为阴性对照组。

1.2.7常用饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴死亡率的影响: 将150 mL鲜橙多、营养快线和可乐于常温下分别加入含12个亚洲带绦虫囊尾蚴的培养皿中，培养皿以塑料盖子覆盖防止液体挥发,作用时间分别设定为1、5、10、30、60、90、120和180 min，作用完后将囊尾蚴以清水彻底冲洗3次，再放入50%猪胆汁中37 ℃培养48 h观察头节翻出情况，测定死亡率，同时设立生理盐水处理组为阴性对照组。

1.2.8数据处理及统计学分析: 以室温下胆汁培养48 h后生理盐水中不能翻出头节的囊尾蚴描述为死亡，可翻出头节视为存活，死亡率=(死亡囊尾蚴数/囊尾蚴总数)×100%。处理后的囊尾蚴死亡率均采用SPSS16.0统计软件分析处理，P<0.05认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 建立亚洲带绦虫囊尾蚴实验感染动物模型

皮下注射0.4 mg地塞米松/日/只小鼠，免疫抑制小鼠252只，均按5 000个六钩蚴/只感染，其中有119只小鼠可在皮下检出囊尾蚴(图1)，感染成功率为47.22%，共检获囊尾蚴1 769个，大小为(1.7±0.1)mm×(3.25±0.25)mm(部分囊尾蚴见图1)，六钩蚴回收率为0.14%。

图1 亚洲带绦虫囊尾蚴实验感染动物模型Fig.1 The experimental infection mouse model of Taenia asiatica左图：黑色箭头示感染60 d后小鼠皮下亚洲带绦虫囊尾蚴；右图：剥离出的亚洲带绦虫囊尾蚴。Left panel: The Taenia asiatica cysticerci from subcutaneous tissue of mouse was demonstrated by the black arrow at day 60 post-infection；Right panel: Taenia asiatica cysticerci were isolated from subcutaneous tissue of infected mice.

2.2 常用调料、酒精饮品和饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴死亡率的影响

根据常用调料对亚洲带绦虫囊尾蚴死亡率的影响(表1)显示，相对于生理盐水对照组，食醋与30%食盐水分别处理囊尾蚴5 min后死亡率均达100%，杀灭作用最佳，10%食盐水和50%蒜汁需处理10 min后囊尾蚴方全部死亡，而酱油、100%姜汁、10%辣椒水和100%柠檬汁分别处理并杀灭全部囊尾蚴的时间分别是15、30、40和40 min。上述数据均具统计学意义(P<0.05)。

据常用酒精饮品对亚洲带绦虫囊尾蚴死亡率的影响(表2)显示，相对于生理盐水对照组，酒精含量56%白酒处理1 min后囊尾蚴死亡率即达到41.67%，3 min后死亡率达到75%，5 min后死亡率达到100%；但酒精含量3.52%～4.80%的啤酒与酒精含量9.5%～15%的红酒分别需要与亚洲带绦虫囊尾蚴作用90和120 min方能致死全部囊尾蚴。上述数据均具统计学意义(P<0.05)。

根据常用饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴死亡率的影响(表3)显示，相对于生理盐水对照组，鲜橙多、营养快线和可乐均不能引起显著的亚洲带绦虫囊尾蚴死亡，其致死率数据不具统计学意义。

表1 常用调料对亚洲带绦虫囊尾蚴死亡率的影响(%)Tab.1 The mortality rate of Taenia asiatica cysticerci treated with different sauces (%)

**：生理盐水对照组；*：与生理盐水对照组比较P<0.05。**: Saline group as control;*:P<0.05.

表2 常用酒精饮品对亚洲带绦虫囊尾蚴死亡率的影响(%)Tab.2 The mortality rates of Taenia asiatica cysticerci treated with different alcohol beverages (%)

**：生理盐水对照组；*：与生理盐水对照组比较P<0.05。**: Saline group as control;*:P<0.05.

表3 常用饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴死亡率的影响(%)Tab.3 The mortality rates of Taenia asiatica cysticerci treated with different soft beverages (%)

**：生理盐水对照组。**: Saline group as control.

3 讨论

根据Ghebrekidan(1992)及Mohamoud等(2003)以牛带绦虫囊尾蚴作为实验对象与食醋、大蒜、啤酒和红酒的结果报道，分别需要5、10、90和105 min方能杀灭囊尾蚴，该结果与本实验的结果基本吻合。但是，本实验结果显示白酒处理亚洲带绦虫囊尾蚴5 min即可杀灭，与Ghebrekidan(1992)报道的白酒处理牛带绦虫囊尾蚴110 min杀灭明显不同，其主要原因可能是国产白酒与国外产白酒在酿造工艺上有差异，而本实验用的白酒酒精度达56.00%，该推测尚需进一步实验证实。此外，本实验结果显示啤酒杀灭囊尾蚴效果优于红酒，而啤酒酒精度(3.52%～4.80%)一般均低于红酒酒精度(9.50%～15.00%)，鉴于白酒(酒精度56.00%)于本实验中杀灭囊尾蚴效果较好，因此我们推测酒精度低于一个阈值对于囊尾蚴的杀灭效果将有较大影响，而且白酒、啤酒和红酒酿造原料、酿造工艺均有较大不同，因此造成了这个结果。该推测尚需进一步实验证实。

本研究发现酒精浓度56%的白酒、醋酸含量4.5%的食醋以及30%食盐水对亚洲带绦虫囊尾蚴具有最佳杀灭效果(表1, 2)，能够在短时间内显著灭活囊尾蚴，该实验结果提示在生食或半生食动物内脏如猪肝等时，适量饮用高浓度白酒，或以高浓度白酒、食醋和高浓度食盐水做调料腌制动物内脏后再食用，有可能降低亚洲带绦虫感染的风险。此外，100%蒜汁、酱油和10%辣椒水也对亚洲带绦虫囊尾蚴具一定的杀灭作用，结合相关研究显示大蒜液相粗提物(Alliumsativum, 系将一定量蒜与等量蒸馏水混合后捣碎，过滤杂质后的水相液)对于微小膜壳绦虫Hymenolepisnana感染和蓝氏贾第鞭毛虫Giardialamblia感染均有一定治疗效果(Soffaretal., 1991；Fallahietal., 2016)，说明一些常用调料可能对绦虫囊尾蚴具有杀灭作用。但是100%姜汁、100%柠檬汁、啤酒和红酒对亚洲带绦虫囊尾蚴的杀灭作用较差，而以鲜橙多、营养快线和可乐为代表的常用饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴不具杀灭作用(表3)。同时有报道显示60 ℃热处理5 min可以使水泡带绦虫T.hydatigena虫卵六钩蚴活性降低99.47%(Buttaretal., 2013)，提示我们在下一步的研究中应考虑食物加热条件下囊尾蚴与常用调料、酒精饮品和饮料的相互作用，应可作为本研究的有益补充。

我国幅员辽阔，民族众多，各地区各民族均有一定的特嗜食物和特殊饮食方法，因此卫生工作者应理解吃生肉和生动物内脏并非某地区或某民族的生活或文化落后，而是传统习俗，无可厚非。本研究采用日常生活常用调料、酒精饮品和饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴进行了体外实验，该研究对于餐桌上的亚洲带绦虫感染防治，以及指导居民改变不良饮食习惯和倡导健康饮食等具有较重要意义。此外，虽然高浓度白酒、食醋和高浓度食盐水在体外对亚洲带绦虫囊尾蚴具有较强的杀灭作用，但其实际效果可受处理时间长短以及肉块大小等多种因素的影响。因此，在有食生肉或动物内脏习俗的地区，应深入开展健康教育，提高居民自我保护意识，并加强对肉类和动物制品的检验检疫(陈利红等，2005)，以确保食品安全。