结直肠癌组织中表皮生长因子受体表达与κ-ras基因突变及蛋白表达的关系

贾晓艳，李 俊，刘 萍，杨宏山

西妥昔单克隆抗体是结直肠癌分子靶向治疗最常用的药物，通过阻断EGFR-Ras-Raf-MAPK途径达到抗肿瘤作用。在西妥昔单抗治疗中，κ-ras基因突变可导致生长信号持续下传而耐药，κ-ras基因突变状态也成为结直肠癌精准治疗的重要组成部分［1］。该研究检测了结直肠癌组织中表皮生长因子受体 （epithelial growth factor receptor，EGFR）表达与κ-ras基因突变及κ-ras蛋白表达的关系，探讨其与结直肠癌病例特征的关系，为临床筛选西妥昔单抗受益人群提供帮助。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取孝感市中心医院2016年—2017年间手术切除的结直肠组织标本95例，其中结肠癌19例，直肠癌76例。样本对应的患者中，男57例，女38例；年龄45～89 岁，其中年龄＜60岁34例，≥60岁61例；发现淋巴结转移者46例，未发现淋巴结转移者49例；TNM分期 （2016结直肠癌AJCC/UICC TNM分期第八版标准）Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期80例。

1.2 方 法

1.2.1 免疫组化染色 全部病例均经中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，3μm连续切片，常规脱蜡水化。采用柠檬酸盐高温高压修复，3%过氧化氢溶液浸泡以消除内源性过氧化氢酶活性，PBS缓冲液震荡冲洗。一抗室温（25℃）孵育1 h，二抗室温孵育80 min 30 s。DBA显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，流水返蓝，风干后中性树胶封片。以已知阳性切片作为对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 组织DNA抽提与测定 采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒进行石蜡包埋组织样本DNA的提取。提取出的样品在多功能酶标仪上进行DNA浓度和纯度的测定。

1.2.3 PCR扩增及基因突变检测 PCR反应扩增κ-ras第2外显子，目的片段长度167 bp。上游引物5'-AGGCCTGCTGAAAATGACT-3'（forward）；下 游引物 5'-AATGGTCCTGCACCAGTAA-3'（reverse）。反应步骤与条件见表1。将PCR产物置于Light Scanner中，收集荧光信号，进行基因突变检测。

表1 PCR反应步骤与条件

1.3 结果判断

1.3.1 免疫组织化学 EGFR蛋白阳性表达表现为细胞膜及部分近细胞膜的胞质可见黄色颗粒，κ-ras蛋白阳性表达表现为细胞质可见黄色颗粒。高倍镜下选择4个视野，按照肿瘤细胞染色强弱计分，未见染色计分0分，淡黄色计分1分，棕黄色计分2分，深棕色、棕褐色、粗颗粒计分3分。按照阳性细胞占所有结直肠癌细胞的比例计分，阳性细胞比例低于25%计分1分，阳性细胞比例25%～50%计分2分，阳性细胞比例50%～75%计分3分，阳性细胞比例高于75%计分4分。染色程度计分与阳性细胞比例计分的乘积为总得分，总得分≥3分为蛋白表达阳性，＜3分为阴性。由两位以上资深病理科医师双盲阅片，得出结果。

1.3.2 高分辨率熔解曲线 将收集到的荧光信号，分别与阳性标准品、阴性对照、空白对照对比，确定样本突变状态。

1.3.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析处理，统计方法采用卡方检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR蛋白在结直肠癌组织中的表达情况如图1所示，EGFR蛋白阳性表达定位于细胞膜，阳性率为81.1%（77/95），在结肠癌与直肠癌中表达率分别为78.9%、81.6%。EGFR蛋白表达与患者其他临床病理指标如性别、年龄，肿瘤发生部位、浸润深度、肿瘤长径、大体分型、远隔转移及TNM分期等无显著相关关系（P＞0.05），具体数据见表2。

图1 EGFR蛋白阳性表达（SP×200）

2.2 κ-ras基因在结直肠癌组织中的突变情况结直肠癌组织中κ-ras基因的突变频率为36.8%（35/95），其中结肠癌突变率为 42.1%（8/19），直肠癌突变率为35.5%（27/76）。突变型熔解曲线如图3、图4所示。基因突变与患者临床病理指标如性别、年龄，肿瘤发生部位、浸润深度、肿瘤长径、大体分型、转移及TNM分期之间无显著相关关系 （P＞0.05），具体数据见表 2。

表2 结直肠癌组织中EGFR蛋白表达、κ-ras基因突变及κ-ras蛋白表达情况

图2 EGFR蛋白阴性表达（SP×200）

图3 κ-ras基因第2外显子突变曲线

图4 κ-ras蛋白阳性表达（SP×200）

2.3 κ-ras蛋白在结直肠癌组织中的表达情况如图5所示，κ-ras蛋白阳性表达定位于细胞质，阳性率60.0%（57/95）。κ-ras蛋白表达与结直肠癌组织的分化程度相关，高中分化组、低分化组的阳性率分别为 66.7%（38/74），50.0%（19/21），P=0.003，二者差异有统计学意义；κ-ras蛋白表达与患者其他临床病理指标如性别、年龄，肿瘤发生部位、浸润深度、肿瘤长径、大体类型、淋巴结转移及TNM分期等无显著相关关系（P＞0.05），具体数据见表2。

2.4 EGFR蛋白表达与κ-ras基因突变，EGFR蛋白表达与κ-ras蛋白表达，κ-ras基因突变κ-ras蛋白表达的相关性 EGFR阳性表达组κ-ras基因突变率为35.1%，EGFR阴性表达组κ-ras基因突变率44.4%，差异无统计学意义（表3）。EGFR阳性表达组κ-ras蛋白表达率与阴性表达组为59.7%和61.1%，差异无统计学意义（表4）。κ-ras突变型组κ-ras蛋白表达率为65.7%，野生型组表达率为56.7%，无统计学差异（表5）。

表3 EGFR蛋白表达与κ-ras基因突变的关系

表4 EGFR蛋白表达与κ-ras蛋白表达的关系

表5 κ-ras基因突变与κ-ras蛋白表达的关系

3 讨论

结直肠癌分子靶向治疗中，最常用的药物为西妥昔单抗［2］。西妥昔单抗是抗EGFR单克隆抗体，可与EGFR特异性结合，通过与EGF、TGF-α竞争受体，抑制生长信号下传，进而抑制细胞增殖，多用于转移性结直肠癌二、三线治疗［3］。然而，在应用过程中，发现部分患者应用西妥昔单抗疗效不明显，可能与耐药有关。针对西妥昔单抗耐药，可能的机制包括：EGFR在结直肠癌中低表达或不表达，EGFR信号通路中下游某些基因自发激活，如κ-ras、nras、b-raf、PI3K突变导致的自发激活及其编码蛋白的自发激活等［4，5］，导致肿瘤的持续生长［6］。EGFR 作为西妥昔单抗的作用靶点，在包括结直肠癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展中起重要作用［7］。但目前尚未发现EGFR表达对结直肠癌的预后及西妥昔单抗的疗效有确定性影响［8］。

κ-ras突变状态是判断患者对西妥昔单抗治疗是否耐药的重要依据，故在使用前需对患者肿瘤组织进行检测，以确定是否有从该药物中获益的可能。另一方面，西妥昔单抗价格高昂，盲目使用不仅给患者带来沉重的经济负担，还可能延误治疗，失去最佳治疗时机。因此，美国国立综合癌症网络（NCCN指南）明确指出，在应用含西妥昔单抗的方案治疗转移性结直肠癌的患者前，均应先检测肿瘤κ-ras基因的突变状态，如该基因为突变型，则西妥昔单抗耐药的可能性大，不推荐使用。然而，并非κras基因为野生型的患者均能从西妥昔单抗中获益，ras基因家族中的n-ras基因突变也可导致患者对西妥昔单抗治疗失败［9］，这部分患者常混杂在κras基因野生型的患者中。除此之外，EGFR信号通路下游的b-raf基因突变也可导致西妥昔单抗耐药。b-raf基因突变还提示肿瘤预后不良，但b-raf抑制剂未能显示抗肿瘤活性［10］。故在条件许可的情况下，应对患者可能影响西妥昔单抗疗效的分子标志物均进行检测，最大限度地保证西妥昔单抗治疗的疗效。

目前实验室κ-ras基因突变检测方法有多种，例如测序法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性测序法（PCR-RFLP）、聚合酶链反应-单链构象多态性分析 （PCR-SSCP）、探针扩增阻滞突变系统（ARMS）、实时荧光定量PCR、高分辨率熔解曲线法等，各种检测方法均有其优缺点。该研究使用的HRM是近年来兴起的一种新的基因突变扫描方法，该方法具有快速、简便、高通量的优点，而且全程闭管操作，不会因交叉污染而导致结果出现偏差。目前也已经有研究证实HRM技术检测基因突变与其他基因突变检测技术相比，具有准确、敏感、操作简便，且价格较低的优势，在实际应用中具有巨大的潜力［11，12］。HRM技术不仅可以检测已知突变，还可以扫描未知突变，但若需明确突变类型，仍需采用其他检测方法进一步检测突变类型。

该研究中，EGFR阳性表达率为81.1%，提示大部分结直肠癌患者存在EGFR单抗类药物靶点。其中EGRR阳性表达组κ-ras蛋白表达率与阴性表达组分别为59.7%、61.1%，差异无统计学意义。提示EGFR蛋白表达对κ-ras蛋白表达无明显影响。κras突变型组κ-ras蛋白表达率为65.7%，野生型组表达率为56.7%，未发现统计学相关性，提示不能通过κ-ras蛋白表达情来预测κ-ras基因突变状态。κ-ras突变对信号链的影响可能并不是通过蛋白表达率来实现的，突变可能影响κ-ras蛋白功能，通过使低度活性的蛋白处于持续活化状态促进生长信号的传递。EGFR蛋白、κ-ras基因与κ-ras蛋白均从一定程度上促进了肿瘤的演进，但三者之间如何相互作用仍不甚清楚，需要大样本的检测与更多实验进一步探讨。未来将会发现更多的方法与技术，更好地筛选分子靶向药物而使人群受益。