血府逐瘀胶囊调节hsa-miR-378a-5p表达研究及生物信息学分析

林凡 张云 黄慧珍 高冬

（1 福建中医药大学中西医结合学院 福建 福州 350122）

（2 福建教育学院 福建 福州 350000）

血管新生（angiogenesis）是在已有血管基础上通过动员诱导内皮祖细胞分化为内皮细胞（endothelial cells，ECs），随后ECs增殖、迁移、黏附等过程生成新血管的过程。在血管异常增生性疾病（如糖尿病、肿瘤）和缺血性疾病（如心肌梗死、脑梗死、冠心病）发生、发展和治疗中，调节疾病相关的血管新生是研究热点之一[1]。血府逐瘀汤为活血化瘀经典方，血府逐瘀胶囊为该方剂常用中成药，在临床上可用于冠心病、糖尿病等血管新生相关疾病的治疗。研究显示，其可适度促进ECs的血管新生[2]。微小RNA（microRNA,miR）是体内基因表达调控的一类重要分子。研究表明，ECs中表达的miR378参与血管新生的调节[3]。血府逐瘀胶囊是否影响ECs 中miR378表达，后者在血管新生过程中如何作用？这些问题尚不明确。

本研究以人微血管内皮细胞（HMEC-1）为材料，分析血府逐瘀胶囊对hsa-miR-378a-5p表达的影响，采用生物信息学方法分析该miR成熟体在血管新生过程中的可能机制，以期为深入研究血府逐瘀汤调控血管新生机制提供理论参考。

1.材料与方法

1.1 细胞株及含药血清

HMEC-1细胞由本实验室保存；含药血清的制备参照文献3所述，血府逐瘀胶囊由天津宏仁堂药业有限公司生产，主要成分为当归、生地黄、炒桃仁、红花、麸炒枳壳、赤芍、柴胡、甘草、桔梗、川芎和牛膝。

1.2 试剂及设备

MCDB-131培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Gibio公司，miRNeasy Mini Kit（217004）购自Qiagen公司，miRNA cDNA第一链合成试剂盒（KR201）、miRNA荧光定量检测试剂盒（FP401）、hsa-miR-378a-5p检测引物（CD201-0584）和内参U6（CD201-0145）引物购自天根生化科技（北京）有限公司，其余试剂均为国产分析纯；CO2培养箱为德国Heraeus公司生产，荧光定量PCR仪（CFX96 Touch）产自美国Biored公司。

1.3 Q-PCR分析血府逐瘀胶囊对HMEC-1细胞hsa-miR-378a-5p表达的影响

HMEC-1细胞进行常规培养，收集对数生长期细胞经同步化处理后随机分为处理组与对照组。处理组加2.5%含药血清处理，以2.5%空白血清处理为对照。给药处理48 h后，收集细胞并参照试剂盒说明书所述方法提取RNA并逆转录为cDNA；采用95℃ 15min, 94℃20s，60℃ 35s，40个循环，以U6为内参进行Q-PCR检测。

1.4 生物信息学分析

综合运用miRanda、miRDB、Pictar2和Targetscan等常用数据库预测hsa-miR-378a-5p靶基因，取交集作为后继分析的基因集合。从OMIM（https∶//www.omim.org/）数据库中检索得到血管新生相关基因，并从HPRD（http∶//www.hprd.org/）数据库中获取人类蛋白数据库作为背景网络。随后用Cytoscape 3.2.1软件分别以预测的靶基因和血管新生相关基因构建“hsa-miR-378a-5p靶点-人类蛋白数据库”、“血管新生相关基因-人类蛋白数据库”蛋白质相互作用网络，分析各节点的度值和两个网络的重合度。最后利用David数据库（https∶//david.ncifcrf.gov/）对在两个网络中重合基因进行功能注释（gene ontology analysis，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG）生物通路数据分析，以P＜0.05为界值。

1.5 统计学方法

采用SPSS22.0进行分析，采用2-△△ct法分析目的基因的表达，实验数据采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 血府逐瘀胶囊促进HMEC-1细胞hsa-miR-378a-5p的表达

与2.5%空白血清对照组相比，2.5%含药血清处理细胞48h可以显著提高hsa-miR-378a-5p的表达水平（图1）。

图1 血府逐瘀胶囊对HMEC-1细胞hsa-miR-378a-5p 表达的影响

2.2 靶基因预测结果

利用4个miR数据库进行靶基因预测，分别得到7154、791、247和12942个靶基因，取4个库共同预测的11个为候选靶基因（表1）。

表1 hsa-miR-378a-5p靶基因预测结果

2.3 预测靶基因的生物信息学分析

将11个候选靶基因构建“hsa-miR-378a-5p靶点-人类蛋白数据库”蛋白质互作（PPI）网络（图2）。该网络包括250个节点，其中度值最高节点为预测靶基因ATXN1（度值154），其次为G蛋白αq亚基（GNAQ，度值40）和环磷酸腺苷应答元件结合蛋白（CREB1，度值38）。

图2 “hsa-miR-378a-5p靶点-人类蛋白数据库”PPI网络

为分析这些蛋白与血管新生关系，获取血管新生相关基因并构建“血管新生相关基因-人类蛋白数据库”PPI网络，并对比2个PPI网络。结果二者这间存在50个重复节点，占hsamiR-378a-5p靶点互作蛋白总数的25%，提示该miR可能通过这50个蛋白调节ECs细胞的血管新生。50个重复节点中包括GNAQ和CREB1两个高度值的靶基因，提示它们可能是该miR调节血管新生的关键靶点。利用DAVID平台对上述结果进行GO富集分析，结果筛选出35个条目（P＜0.05），可聚集成7类。其中涉及生物过程有18条，包括蛋白磷酸化、胞内信号转导、RNA转录等；涉及分子功能有13条，包括蛋白激酶活性、ATP结合、RNA转录起始、泛素蛋白连接酶结合等；涉及细胞组成有4条，涉及核染色质、质膜、膜筏、黏着斑等（表2）。进行KEGG通路注释分析，筛选出显著54条通路（P＜0.05），其中包括VEGF信号、黏附斑、细胞周期、PI3K-Akt、ErbB信号、mTOR信号等血管新生信号途径（表3）。

表2 血管新生相关hsa-miR-378a-5p靶蛋白互作蛋白的GO条目示例

表3 与血管新生相关的KEGG经典生物通路示例

3.讨论

miR在广泛参与血管新生的各种过程。一些研究表明，miR-378可通过促进细胞迁移，侵袭和血管新生在肿瘤的发生、转移中起重要作用，如非小细胞肺癌[5]、卵巢癌[6]。血府逐瘀汤出自清代王清任的《医林改错》，为活血化瘀的代表方之一。多项研究表明血府逐瘀汤可适度调节血管新生，具有多组分、多靶点、多途径的作用特点。本研究在前期miR测序基础上，通过Q-PCR方法证明血府逐瘀汤可促进HMEC-1中hsa-miR-378a-5p的表达，提示其可能参与了血府逐瘀汤调节ECs血管新生的过程。

miR大多具有复杂的调控功能，利用生物信息学方法进行分析，为后继实验验证提供有力的资料是常用策略。hsa-miR-378a-5p靶基因预测筛选出11个候选基因，PPI网络分析结果表明GNAQ和CREB1两个靶基因与人体较多蛋白质具有互作关系。其中GNAQ编码Gα（q）亚基,是G蛋白信号调节途径的中心结构，参与多种细胞信号转导过程，其突变可导致先天性血管瘤发生[7]。CREB1参与氧诱导的视网膜新生血管，可能调节PI3K/Akt及VEGF-A信号[8]。GO和KEGG通路分析结果提示，hsa-miR-378a-5p可能通过调节细胞蛋白磷酸化水平，通过影响VEGF信号、黏附斑、PI3KAkt、ErbB信号等血管新生信号途径参与血管新生的调节。其中VEGF参与血管新生全过程，联系PI3K-Akt、mTOR等信号通路，作用关键。前期研究亦表明血府逐瘀汤可调节ECs中VEGF的表达，进而调节血管新生[3]。

综上所述，血府逐瘀汤调节HMEC-1细胞中hsa-miR-378a-5p表达；该miR可能作用于GNAQ、CREB1等基因，通过调节VEGF等信号途径参与这一过程。