抗扑海因内生木霉菌株PJ3与原始菌株J3的生物学特性差异

鲁海菊， 董文彦， 沈云玫， 洪 亮， 李 珣

(红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自 661199)

木霉是重要的内生真菌，广泛分布于芦荟[1]、芦竹[2]、银杏[3]、红豆杉[4]、板蓝根[5]、枸骨[6]、滇牡丹[7]、香榧[8]等药用植物中，能定殖于植物的根[5，9-10]、茎(树皮)[4，11]、叶[12]，能抑制细菌[13]、真菌[14]及线虫[15]生长，对植物有防病促生作用[16-19]。因此，利用内生木霉控制植物病害已成为研究热点之一。有学者尝试用香蕉内生木霉防治香蕉枯萎病[20]，茶树内生木霉防治茶花褐斑病[21]，杨树内生木霉防治杨树溃疡病[22]，枇杷内生木霉防治枇杷根腐病，均已取得阶段性成果。木霉菌剂施入土壤，对植物根际土壤真菌群落影响较小[23-24]。木霉在土壤中定殖是其防病促生的前提条件，然而，它在土壤中的定殖能力，通常会受到土壤农药残留因素的限制。因此，筛选抗化学农药的木霉菌株尤为重要。鉴于此，本研究从具有抗枇杷根腐病病菌活性的枇杷内生木霉中，筛选到1株抗扑海因的菌株PJ3，其原始菌株J3对枇杷根腐病、万寿菊叶斑病、石榴枯萎病和石榴干腐病等病原菌均具有极强的抑菌作用。经测定菌株PJ3的抑菌活性未衰退，为明晰此菌株的其他性状是否衰退，有必要明确其与原始菌株J3的生物学特性差异。本研究测定不同培养基、碳源、氮源、pH值、温度和光照对菌株PJ3、J3菌丝生长及其产孢的影响，为其工业发酵提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 木霉菌株J3，采用常规组织分离法[24]从枇杷主干韧皮部中分离纯化获得，PJ3是在含扑海因药剂(100 mg/L)的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中生长的J3抗药性菌株。将菌株置于斜面培养基低温(4 ℃)保存，现保存于云南省红河学院生命科学与技术学院植物病理教学实验室。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基：20%马铃薯浸汁，2%葡萄糖，琼脂18 g，水1 000 mL；胡萝卜葡萄糖琼脂(CDA)培养基：20%胡萝卜浸汁，2%葡萄糖，琼脂18 g，水1 000 mL；香蕉葡萄糖琼脂(BDA)培养基：20%香蕉浸汁，2%葡萄糖，琼脂18 g，水 1 000 mL；查氏(CM)培养基：蔗糖30.00 g、NaNO32.00 g、K2HPO41.00 g、KCl 0.50 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、水 1 000 mL。

1.1.3 试剂 碳源：可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖、葡萄糖、D-果糖、蔗糖、鼠李糖、甜醇、D-甘露醇；氮源：硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素；盐酸、氢氧化钠和扑海因。

上述材料均购自农贸市场及试剂公司，试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 不同培养基对菌丝生长及其产孢的影响 将菌株J3、PJ3接种到已灭菌的PDA培养基中央，28 ℃扩大培养 7 d。在培养基同一半径周围用打孔器，取直径为5 mm的菌块，同时接种于PDA、CDA、BDA、CM 4种培养基平板中央，3次重复，在28 ℃下恒温培养7 d，采用十字交叉法测定菌落直径，采用血球计数板计数产孢量。

1.2.2 不同碳源、氮源对菌丝生长及其产孢的影响 以CM培养基为基础培养基，分别用相等质量分数的碳(可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖、葡萄糖、D-果糖、蔗糖、鼠李糖、甜醇、D-甘露醇)和氮(硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素)替换蔗糖和硝酸钠，以不加碳、氮为对照。每个处理3次重复，接种及测量方法同“1.2.1”节。

1.2.3 不同pH值对菌丝生长及其产孢的影响 以PDA为供试培养基，分别用0.1%盐酸及0.1%氢氧化钠溶液将pH值调至3、4、5、6、7、8、9、10之后倒平板，每个处理重复3次。接种及测量方法同“1.2.1”节。

1.2.4 不同温度对菌丝生长及其产孢的影响 以PDA为供试培养基，接种后分别在10、15、20、25、28、30、35、40 ℃下恒温培养，每个处理重复3次，接种及测量方法同“1.2.1”节。

1.2.5 光照对菌丝生长及其产孢的影响 以PDA为供试培养基，接种后分别在光暗交替(12 h光照12 h黑暗)、全黑暗和全光照3种光处理下培养，每个处理重复3次。接种及测量方法同“1.2.1”节。

以上所有配制好的培养基用高压蒸汽灭菌锅在121 ℃条件下灭菌25 min。

1.2.6 数据统计 所有试验数据均采用SPSS 19.0统计软件Duncan’s多重比较法进行统计分析，计算处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对参试菌株菌丝生长及产孢的影响

由表1可知，参试菌株在供试的4种培养基中均能生长，在PDA、CDA和BDA 3种培养基中参试菌株菌落直径差异不显著，CM培养基中参试菌株菌落直径与其余3种培养基差异极显著，菌落直径最小。原始菌株J3在4种培养基中均能产孢，但在4种培养基中的产孢量差异极显著，其中在CDA培养基中产孢量最大，为2.59×108个/mL，CM培养基中产孢量最小，为0.12×108个/mL，相差近200倍。抗扑海因菌株PJ3在4种培养基中的产孢量差异极显著，其中在BDA培养基中产孢量最大，为2.70×108个/mL，CM培养基中产孢量最小，为 0.19×108个/mL。说明抗扑海因菌株PJ3与原始菌株J3相比，在产孢能力方面，对营养要求有所改变，CDA培养基最适合原始菌株J3产孢，BDA培养基最适合抗扑海因菌株PJ3产孢，在PDA培养基中，抗扑海因菌株PJ3比原始菌株J3产孢能力增强近1倍。

表1 不同培养基对参试菌株菌丝生长及产孢量的影响

注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显著；不同大写字母表示在0.01水平上差异显著。下表同。

2.2 不同碳源对参试菌株菌丝生长及产孢量的影响

由表2可知，原始菌株J3在供试的9种碳源培养基中菌落直径均大于对照，且均与对照差异极显著。其中，以D-果糖为碳源时菌落直径最大，为88.0 mm，以甜醇为碳源时菌落直径最小，为45.0 mm；抗药菌株PJ3在可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖和葡萄糖4种碳源培养基及甜醇和鼠李糖2种碳源培养基中，两两菌落直径差异不显著，与其余碳源培养基差异极显著，其中在可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖和葡萄糖4种碳源培养基中菌落直径最大，为88.0 mm，在以蔗糖为碳源的培养基中菌落直径最小，为79.0 mm。原始菌株J3的产孢量在以蔗糖和D-甘露醇为碳源的培养基中差异不显著，其余碳源培养基之间差异极显著，其中，以D-果糖为碳源时产孢量最大，为6.50×107个/mL，以可溶性淀粉为碳源时产孢量最小，为0.98×107个/mL；抗药菌株PJ3在9种碳源中产孢量均差异极显著，其中在以D-果糖为碳源对产孢量最大，为3.65×107个/mL，以甜醇为碳源时产孢量最少，为 0.11×107个/mL。整体而言，抗扑海因菌株PJ3与原始菌株J3相比在不同碳源培养基中的菌丝生长能力增强，产孢能力略有下降。

2.3 不同氮源对参试菌株菌丝生长及产孢量的影响

由表3可知，参试菌株在供试的8种氮源培养基中，菌落直径与对照均差异极显著。其中，原始菌株J3在以酵母膏为氮源时菌落直径最大，为88.0 mm，在以尿素为氮源时菌落直径最小，为18.8 mm。抗扑海因菌株PJ3菌落直径在除尿素和无氮对照外的其余7种氮源培养基中， 菌落直径差异不显著，其中在牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、磷酸二氢铵和甘氨酸7种氮源培养基中，菌落直径最大，均为88.0 mm，在以尿素为氮源的培养基中菌落直径最小，为 22.0 mm。原始菌株J3和抗扑海因菌株PJ3在8种氮源培养基中均能产孢，其中在以酵母膏为氮源的培养基中产孢量最大，分别为3.00×108、2.63×108个/mL，在以尿素为氮源的培养基中产孢量最小，分别为0.02×108、0.01×108个/mL。说明酵母膏为最适合J3、PJ3菌株生长及产孢的氮源。

表2 不同碳源对参试菌株菌丝生长及产孢的影响

表3 不同氮源对参试菌株菌丝生长及产孢的影响

2.4 不同pH值对参试菌株菌丝生长及产孢量的影响

由表4可知，原始菌株J3在pH值为3～9的培养基中均能生长并产孢，且菌落直径及产孢量间差异极显著。其中pH值为8时，菌落直径及产孢量均最大，分别为88.0 mm、8.88×108个/mL。pH值为10时不能生长及产孢。抗扑海因菌株PJ3在培养基pH值为3～10时，菌落直径差异不显著，均为88.0 mm。在8个pH值梯度培养基中均能产孢，且产孢量间差异极显著，其中pH值为10时产孢量最大，为19.38×108个/mL，pH值为7时产孢量最小，为4.00×108个/mL。说明抗扑海因菌株PJ3的生长及产孢性能对pH值适应性更强。

2.5 不同温度对参试菌株菌丝生长及产孢量的影响

由表5可知，参试菌株在15～30 ℃范围内菌丝均能生长，且菌落直径差异不显著，均为88.0 mm。原始菌株J3在25～30 ℃范围内能产孢，且产孢量之间差异极显著，其中 28 ℃ 时产孢量最大，为25.75×107个/mL，30 ℃时产孢量最小， 为 0.35×107个/mL， 其余温度均不能产孢。抗扑海因菌株PJ3在20～30 ℃范围内均能产孢，且产孢量之间差异极显著，其中28 ℃时产孢量最大，为62.50×107个/mL，20 ℃ 时产孢量最小，为0.85×107个/mL，其余温度均不能产孢。抗扑海因菌株PJ3与原始菌株J3相比，产孢量明显增强。

表4 pH值对参试菌株菌丝生长及产孢量的影响

表5 温度对参试菌株菌丝生长及产孢量的影响

2.6 不同光处理对参试菌株菌丝生长及产孢量的影响

由表6可知，在光暗交替(12 h光照12 h黑暗)、全黑暗和全光照3种光处理下，参试菌株菌落直径差异不显著，均为 88.0 mm。菌株PJ3在全黑暗处理时不产孢，其余2种处理均能产孢，且产孢量差异极显著，其中光暗交替处理产孢量最大，为 4.75×108个/mL。原始菌株J3在3种光处理下，均能产孢，且产孢量间差异极显著，其中光暗交替处理产孢量最大，为2.56×108个/mL，全黑暗处理产孢量最小，为 0.13×108个/mL。另外，在光暗交替下，抗扑海因菌株PJ3比原始菌株J3产孢量增强近1倍。

表6 光对参试菌株菌丝生长及产孢量的影响

3 结论与讨论

本研究筛选获得抗扑海因的枇杷内生木霉菌株PJ3，其菌丝生长的适合条件为PDA、CDA或BDA培养基，适合碳源为可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖或葡萄糖，适合氮源为牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、磷酸二氢铵或甘氨酸，适宜pH值为3～10，温度为15～30 ℃，光照条件为光暗交替、全黑暗或全光照。原始菌株J3菌丝生长适合条件为PDA、CDA或BDA培养基，适合碳源为D-果糖，适合氮源为酵母膏，最适pH值为8，适合温度为15～30 ℃，适合的光照条件为光暗交替、全黑暗或全光照。前者产孢最佳条件为BDA培养基、碳源为D-果糖、氮源为酵母膏、pH值为10、温度 28 ℃、光照条件为光暗交替；后者为CDA培养基、碳源为D-果糖、氮源为酵母膏，pH值为8，温度28 ℃、光照条件为光暗交替。由此可见，抗扑海因内生木霉菌株PJ3菌丝生长适应性比原始菌株J3范围广。二者适应的培养基和pH值不同，菌株PJ3为BDA培养基和pH值为10，菌株J3为CDA培养基和pH值为8，其余参数均相同。产孢数量方面，除了不同碳、氮源之外，在其余参数中，抗扑海因菌株PJ3整体强于原始菌株J3。段银芝等研究发现，吡虫啉、咪唑乙烟酸和咪唑烟酸3种农药能促进哈茨木霉菌丝生长及产孢[25]。前人曾筛选获得耐多菌灵[26]、速克灵[27-28]，能降解敌敌畏[29]、毒死蜱和甲胺磷[30]等的木霉菌株，但尚未见抗药性菌株其他生物学特性是否衰退的报道。本研究表明，与原始菌株J3相比，抗扑海因枇杷内生木霉菌株PJ3产孢能力增强，且其他生物学特性未衰退。田连生等报道，木霉菌剂与多菌灵混配防治灰霉病有协同增效作用[31]。任凤山等发现，木霉与几种杀菌剂混配能增强对苹果轮纹病的防治效果[32]。此抗药性菌株PJ3可与扑海因混配使用，可以减少化学农药用量，保护农业生态环境，具有广阔的开发应用前景。