维生素D受体与慢性阻塞性肺病易感性的关联

郑蓉蓉

(南京医科大学附属江苏盛泽医院, 江苏 苏州, 215228)

慢性阻塞性肺病(COPD)主要表现为喘气、胸闷，严重时可导致呼吸困难[1], COPD的病变机制至今仍未完全明确。临床研究[2]发现, COPD患者缺乏维生素D的现象较为常见，维生素D与维生素D受体(VDR)结合，才能发挥其生物学功能。维生素D可与这些VDR结合，参与呼吸系统的免疫功能调节[3]。VDR分子的表达受其基因单核苷酸多态性(SNP)调控[4], 目前关于维生素D受体基因多态性与COPD易感性的研究较少，本研究采用病例对照研究分析了维生素D受体及其基因多态性与COPD易感性的关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年6月—2017年6月本院门诊收治的COPD患者129例作为病例组，患者均符合COPD相关诊断标准，且排除心脑血管疾病、肝肾系统疾病及其他严重肺部疾病。对照组按照年龄、性别匹配，选取同一时期在该院体检中心参加体检的健康人群139例。所有对象空腹采集5 mL的EDTA抗凝血，并在收集血液标本的同时，由经专门培训的调查员完成流行病学问卷调查。

1.2 实验方法

采用实时荧光定量PCR检测50例患者和50例对照者的外周血单个核细胞(PBMC)中VDR mRNA表达情况，反应在ABI 7500 PCR仪中进行，荧光定量PCR的结果以每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数Ct值表示。Ct值减去管家基因β-actin的Ct值得到△Ct, △Ct值越小, VDR基因表达量就越高。采用酚-氯仿法提取所有研究对象细胞基因组DNA。结合在汉族人群中研究过的多态性位点以及从NCBI、HapMap等数据库中提供的有关VDR基因位点基因型数据，最终选定FokI与ApaI各3个位点。运用TaqMan-MGB荧光探针PCR法检测所有研究对象的FokI与ApaI位点基因型。反应在ABI 7900 PCR仪中进行，采用SDS2.3软件读取检测数据。

1.3 统计学分析

应用EpiData3.10、SPSS17.0、PHASE 2.0软件对数据进行处理。采用t检验比较COPD组与健康对照组中的VDR mRNA表达水平。采用多因素Logistic回归分析VDR基因多态性在对照组与病例组中的分布差异。采用协方差分析VDR mRNA在VDR基因阳性位点不同基因型组别中表达情况。

2 结 果

2.1 研究对象的基本情况

2组人群年龄、性别及吸烟的分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。以研究对象每天吸烟支数×吸烟年数计算出吸烟指数，吸烟指数≥400代表大量吸烟, <400代表轻度吸烟。结果显示，病例组的吸烟指数和健康对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 病例组与健康对照组一般情况比较

2.2 VDR mRNA在病例组与对照组中表达分布情况

采用荧光定量PCR检测50例COPD患者与50例对照者PBMC中的VDR mRNA, 结果发现, COPD患者中VDR mRNA△Ct值为(9.12±0.92), 对照者VDR mRNA△Ct值为(7.29±1.03), COPD患者中VDR mRNA的表达量显著低于对照者，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 VDR基因多态性与COPD易感性的关联

多因素Logistic回归分析结果显示, FokI点Ff基因型在病例组中的分布显著高于健康对照组(调整OR=1.96, 95%CI=1.32～2.92)(P<0.05), 未发现ApaI位点各基因型在对照组与病例组中分布存在差异。见表2。

表2 VDR基因多态性与COPD易感性的关联分析

与健康对照组比较, *P<0.05。

2.4 VDR基因FokI位点不同基因型组别中

VDR mRNA表达情况

采用方差分析方法分析阳性位点FokI不同基因型组别中VDR mRNA表达情况，结果发现，对照组与病例组FokI位点不同基因型中VDR mRNA表达水平存在统计学差异(P<0.01), 见表3。

表3 VDR mRNA水平在FokI位点不同基因型中的分布

与对照组比较, **P<0.01。

3 讨 论

COPD的发病机制尚未完全清楚，但已有研究表明COPD是由多种炎症细胞介导、炎症细胞因子参与的呼吸道慢性炎症[5]。1, 25-(OH)2D3是体内维生素D的活性形式，除在机体调节钙代谢方面发挥重要作用外，其也积极参与机体抗炎、抗分化及免疫调节过程[6]。一方面，在固有性免疫应答中, 1, 25-(OH)2D3通过介导NF-κB信号转导途径减少机体干扰素、趋化因子等细胞因子的释放，从而减轻炎症反应; 另一方面，在获得性免疫中，维生素D主要通过与巨噬细胞、树突状细胞等结合来发挥作用[7]。

维生素D在体内发挥生物学效应依赖于与VDR的结合。VDR表达异常可影响多种疾病的发生、发展。本研究发现, COPD患者VDR mRNA表达水平显著低于对照者。王东梅等[8]对11篇有关维生素D与COPD相关性的研究进行Meta分析，结果发现, COPD患者普遍缺乏维生素D, 补充维生素D可显著改善COPD患者的肺功能，因此可推测COPD患者体内VDR介导的维生素D信号通路传导可能减弱，进而参与COPD的发病机制。

近年来, VDR基因多态性已被发现与多种炎症相关疾病的发病风险存在关联[9]。其中研究最多的是VDR的4个限制性酶切位点FokI、TaqI、BsmI、ApaI[10]。Guy等[11]发现在高加索人群中BsmI位点的突变基因型bb可增加乳腺癌的患病风险。毕雪冰等[12]在汉族人群中发现FokI位点多态性与肺癌的易感性存在关联。由于TaqI与BsmI突变野生基因型在汉族人群中分布较少，因此本研究只分析了FokI、ApaI位点多态性与COPD易感性的关联，结果发现, FokI位点杂合基因型Ff在病例组中的分布显著高于对照组，提示F等位基因可能增大COPD的患病风险。FokI位点位于VDR基因的第2外显子，已有研究报道其突变可改变VDR翻译编码蛋白。进一步采用单倍型分析发现, FokI位点可能在VDR基因单倍型区段中发挥着主效应。FokI位点位于VDR基因第2外显子，是目前唯一能改变氨基酸序列的位点。该位点发生突变可导致VDR翻译出的蛋白质比正常编码少3个氨基酸，从而最终影响维生素D信号通路[13]。本研究也发现, FokI位点的多态性与VDR mRNA表达水平存在关联，这进一步验证了其他学者[14]关于FokI位点的多态性与VDR mRNA表达有关，从而影响机体疾病的易感性及严重程度的研究。

综上所述，本研究在汉族人群中选择VDR基因的2个限制性酶切位点，发现VDR基因FokI位点的遗传变异与COPD发病风险的关系，为探讨候选基因与COPD易感性关系提供了可供参考的范例。但本研究同时也存在着一些不足，如样本量较小，样本全部选自医院，此外本研究只对VDR基因部分区段进行分型，不可避免会产生位点选择偏倚，因此还需进一步扩大样本量，同时采用精细作图方法探索遗传因素在COPD致病机制中的作用。