十二井穴放血对不同程度颅脑创伤大鼠脑水肿及端粒 生物合成的影响❋

， ， ，

(1. 天津医科大学，天津 300070； 2. 天津市北辰医院脑系科，天津 300400； 3. 武警后勤学院附属医院脑科中心/天津市神经创伤修复重点实验室，天津 300162)

随着社会交通运输业的快速发展，颅脑创伤(traumatic brain injury，TBI)的发生率逐年增高，其高致残率和致死率给社会和家庭造成严重负担，而TBI后继发的脑水肿是致残和致死的重要原因之一，因此有效地控制脑水肿是治疗TBI的关键[1]。有研究表明，十二井穴放血疗法对于改善TBI后脑水肿有一定疗效，但相关机制仍未阐明[2]。端粒(telomere，TEL)是真核细胞染色体末端的一段非编码重复序列(TTAGGG)，其可随着年龄的增长及氧化应激、炎症等因素的累积而不断缩短，当缩短到一定程度时则会造成细胞凋亡[3]。另外端粒的缩短还可激活p53蛋白，进而造成线粒体功能障碍，使细胞内乳酸堆积并形成水肿[4]。这提示端粒可能是十二井穴放血疗法发挥脑保护作用的靶点之一。本实验通过脑皮质撞击致法构建不同损伤程度的TBI大鼠模型，以探讨十二井穴放血疗法对脑水肿的影响，同时进一步检测端粒生物合成的相关基因表达，以及端粒拷贝数的变化，从而为挖掘十二井穴放血疗法治疗TBI的机理提供更多的基础支持。

1 材料

1.1 实验动物

雄性SD大鼠56只，7～8周龄，体质量220～250 g，购自军事医学科学院动物实验中心。

1.2 主要实验设备与试剂

脑皮质撞击仪(美国Custom&Design公司)，real-time PCR仪(StepOne Plus，美国ABI公司)，RNA/DNA共提取试剂盒(北京天根公司)，实时荧光定量试剂盒(北京康为世纪公司)。

2 方法

2.1 动物分组及TBI模型的构建

将大鼠随机等分为7组，包括对照组(Control Group)，轻、中、重度TBI组(L，M，H Group)以及轻度TBI+井穴放血组、中度TBI+井穴放血组、重度TBI+井穴放血组(L+B，M+B，H+B Group)每组各8只。各TBI组经5%水合氯醛按6 ml/kg给予麻醉后，暴露右侧大脑皮质，开口直径约4.5 mm，调整CCI打击臂至与垂直方向呈约20°夹角，使用直径3 mm的打击帽打击大脑皮质，打击速率为5 m/s，最低点持续时间为0.2 s，轻、中、重度TBI组的打击深度分别为1 mm、3 mm、4 mm[5]。对照组仅开骨窗后缝合皮肤不进行打击。

2.2 十二井穴放血

参考人体相应穴位的解剖标志，用1 ml 注射器针头点刺大鼠双侧前肢趾尖端的十二井穴，出血量为10 μL/穴，与TBI后立即行放血疗法，此后每12 h进行1次放血共6次，穴位的定位方法采用比较解剖学。

2.3 mNSS评分及标本采集

7组大鼠均于术后第72小时行mNSS评分[6]，0分为正常，18分为最严重，分数越高说明症状越严重。评分后采用颈椎离断法处死大鼠，各组均取损伤部位周边同一位点的脑皮质约10 mg，进行后续DNA/RNA的提取，剩余脑组织进行含水量测量。

2.4 相关基因表达及端粒拷贝数测定

表1显示，提取脑组织基因组DNA和总RNA，并将RNA反转录成cDNA，以测定端粒生物合成相关基因的表达变化，包括端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)、端粒重复序列结合因子1(telomeric repeatbinding factor1，TRF1)以及TEL拷贝数。方法如下：配制25 μL PCR反应体系，其中样本量为cDNA 10ng或基因组DNA50 ng，每个基因均设置3个复孔。反应条件为两步法：95 ℃ 10 min预变性，随后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40个循环，以0.3 ℃为升温梯度行融解曲线分析。应用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。

2.5 脑组织含水量测定

取脑后仅留取左右大脑半球，立即称重，所得质量为湿重。将大脑放至烘箱中75 ℃烘烤48 h称重，所得质量为干重。含水量=(湿重-干重)/湿重。

2.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，3组比较采用单因素方差分析，采用LSD法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 神经功能损伤评分

表2显示，TBI后大鼠mNSS评分均显著升高，且随着TBI的严重程度增加评分依次增高(P<0.05)，轻度、中度TBI组大鼠在施加井穴放血疗法后，mNSS评分与相应的轻度、中度TBI组比较显著降低(P<0.05)。

3.2 各基因表达及mtDNA拷贝数变化

表2显示，TBI后各组大鼠与对照组比较，TEL拷贝数显著降低，TRET和TRF1基因表达显著升高，且TBI越严重TEL拷贝数越低(P<0.05)；施加井穴放血后，与相应单纯损伤组比较，轻、中度TBI组大鼠TEL拷贝数、TRET和TRF1基因表达均显著升高(P<0.05)。

3.3 脑组织含水量

表2显示，TBI后各组大鼠脑组织含水量与对照组比较均显著增高，且轻、中度TBI组大鼠在应用井穴放血疗法后脑组织含水量与相应的单纯损伤组比较显著降低(P<0.05)。

4 讨论

脑水肿是TBI后常见的并发症，一般于发病后第2～4天达到高峰，主要由创伤造成的氧化应激、炎症反应以及细胞缺血缺氧引起，导致颅内压急剧增高，进一步加重病情甚至造成脑疝威胁生命[7]。井穴位于四肢末端，是十二经脉气血的起始之处，针刺可促使气血流行，有起死回生救急之妙用[8]。本实验中，应用井穴放血疗法后有效减轻轻度和中度TBI组大鼠神经功能损伤症状，并减轻TBI后脑水肿，表明对于轻中度颅脑创伤应用井穴放血疗法可发挥脑保护作用。这与部分学者得出的结论一致。苗笑梅等[9]发现，十二井穴放血疗法可以减轻创伤大鼠神经功能缺陷，改善脑水肿，对脑组织有保护作用。张静莎等[10]也发现，手十二井穴放血疗法有改善颅脑创伤患者意识状态的作用，但上述研究均未深入探讨其潜在机制。端粒是机体内调控细胞凋亡的重要基因序列，当TEL拷贝数减少至一定程度时，可抑制线粒体氧化呼吸链相关蛋白基因的转录与表达，导致线粒体功能障碍，进而通过端粒-线粒体途径造成细胞凋亡，引起脑水肿[11]。为此该实验检测了损伤后脑组织中端粒生物合成相关基因表达及TEL拷贝数的变化，以期探索十二井穴放血疗法发挥脑保护作用的靶点。

表2 各组大鼠mNSS评分及基因表达变化

注：与对照组比较:*P<0.05；与相应单纯损伤组比较:#P<0.05

本实验发现，TBI后脑组织中TEL拷贝数显著降低，脑水肿明显，表明创伤或可通过造成端粒损伤而加重脑水肿。一方面，当机体因创伤进入应激状态时，过多的活性氧族及炎症因子可直接造成端粒的缩短，受损的端粒诱导P53基因表达，启动线粒体凋亡信号通路，促使细胞毒性脑水肿的发生[12]。另一方面，这些因子还可以通过抑制端粒酶表达，抑制端粒酶及端粒结合蛋白TRF1的活性，降低端粒-端粒酶修复系统的功能，促进端粒加速缩短[13]。同时本实验结果可见，TERT及TRF1基因表达显著升高，这可能是当端粒修复系统受到抑制时，端粒生物合成基因发生代偿性升高的结果。当应用井穴放血疗法后，可见大鼠的TERT及TRF1基因表达进一步升高，且TEL拷贝数明显提高，表明十二井穴放血可能是通过激活端粒生物合成相关基因的表达，促进损伤端粒的修复，从而减少线粒体功能障碍及细胞凋亡，增加细胞能量供应，减轻脑水肿严重程度，发挥脑保护作用。但是对于重度TBI组大鼠，单独应用井穴放血疗法虽可使TEL拷贝数在一定程度上有所增加，但未能显著改善神经功能障碍及脑水肿严重程度，这可能源于重型TBI因损伤严重，可同时累及多条信号通路、多因素综合作用加重脑水肿的形成，单独应用井穴放血不足以展现出改善脑水肿的效果，提示在应对重型TBI时需多种治疗策略综合施治，辅以十二井穴放血疗法，或可有更好的治疗效果。

综上所述，本实验通过构建不同程度TBI大鼠模型，探讨了井穴放血疗法对脑水肿及端粒生物合成基因表达的影响，为阐明井穴放血疗法发挥脑保护作用的机制提供了基础研究。但TBI的发生发展还涉及多条通路及靶基因，这仍有待挖掘。若能进一步研究井穴放血疗法对其他通路的影响，或许可为TBI的临床治疗乃至开发井穴放血疗法的新用途提供帮助。