开通玄府法对脑出血后血脑屏障双向调节的作用❋

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(西南医科大学附属中医医院心脑病科，四川 泸州 646000)

出血性脑卒中是临床常见的危急重症，而脑出血后脑水肿是导致病情进一步加重甚至死亡的关键因素[1]，其水肿的发生发展又与血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的破坏与功能障碍密切相关。然而目前尚未发现具有调节BBB功能障碍的西药，但已有研究发现芳香开窍类中药对BBB通透性具有双向调节作用[2]。本课题组继承全国名老中医王明杰的“玄府理论”学术思想，发现脑之玄府在结构与功能上均与BBB具有着明显的相关性[3]，但是尚不明确以开通玄府为法的风药组方是否如同芳香开窍药对BBB仍具有双向调节的作用，是否能双向调节脑出血后BBB的功能障碍，从而减轻脑水肿。因此，本实验在前期研究成果及临床经验的基础上，拟定风药、虫类药组方以开通脑之玄府，研究开通玄府法对脑出血后BBB所具有双向调节的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康雄性SD大鼠60只，体质量270～320 g，由西南医科大学动物实验中心提供(许可证号SCXK(川)2013-17)。

1.2 主要药物及试剂

祛风通窍方组成：麻黄 10 g，麝香0.1 g，水蛭3 g，地龙10 g，全蝎5 g，茯苓15 g，石菖蒲10 g。其中水蛭、地龙、全蝎经醇化提取，石菖蒲提取挥发油，除麝香外全方药味水煎并浓缩至2 g/ml，麝香研磨加入浓缩液。试剂：水合氯醛:Solarbio(批号421E021)；戊巴比妥钠，由西南医科大学药理实验室提供；0.5%伊文思蓝(Evens blue):Solarbio(批号20170412)。

1.3 主要实验仪器

大鼠脑立体定位仪，由西南医科大学神经生物学教研室提供；50 μl微量进样器，上海高鸽工贸有限公司；Multiskan FC 酶标仪，Thermo；FA2204B电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司。

1.4 动物分组及给药

将60只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、加减祛风通窍方低、中、高剂量组(分别简称为“低剂量组”“中剂量组”“高剂量组”)每组各12只。大鼠造模前12 h灌胃1次，造模后每天灌胃1次，共灌胃7次。给药剂量换算:大鼠的剂量(mg/kg)=折算系数(W=6.25)×人的剂量(mg/kg)，即低、中、高剂量组分别为2.77、5.53、11.06 g/kg·d-1。

1.5 动物造模及模型评估

大鼠术前禁食禁饮12 h，称重后2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)、10%水合氯醛(200 mg/kg)分别腹腔麻醉，俯卧位固定于脑立体定位仪，头部及尾部备皮消毒，沿头皮正中纵行切开约1 cm，双氧水腐蚀骨膜，参照《大鼠脑立体定位图谱》[4]进行尾壳核定位(前囟前0.2 mm，中线右侧旁开3.0 mm处)，12号针头钻孔直径约1 mm，暖水袋包裹鼠尾2～3 min，距鼠尾尖3～4 cm用10号刀片尖切断尾动脉，微量进样器取不抗凝血50ul，针尖中点自钻孔处颅骨表面进5.5 mm，按20ul/min匀速注血，留针15 min缓慢退针，骨蜡封孔，缝合头皮，青霉素8U腹腔注射。假手术组以生理盐水代替自体血。参照Zea Longa[5]5分制法制定神经功能缺损评分：无神经功能缺损症状，记0分；提尾倒挂时血肿对侧前肢紧贴胸壁或不能伸展，记1分；行走时向一侧转圈追尾,且血肿对侧前肢长拖或蜷缩，或有上述1分症状伴侧推时轻瘫侧抵抗力减弱，记2分；行走或站立时向血肿对侧倾倒，记3分；意识障碍且不能行走，记4分，1～3分者为模型成功纳入实验。死亡大鼠及造模不成功大鼠随机补充。

1.6 标本采集

术后6 h、3 d、7 d 3个时点取各组内4只大鼠，0.5%伊文思蓝(6 ml/kg)经尾静脉注射见巩膜及皮肤变蓝，循环1 h后10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉，迅速开胸暴露心脏，用接有输液器的磨钝10号针头与心尖左缘成 45°向上进针，插送至主动脉起始部，止血钳固定针头，剪开右心耳，4 ℃生理盐水100 ml快速滴注，并用止血钳夹闭腹主动脉，至右心耳流出清澈液，改用4%多聚甲醛50 ml先快后慢滴注，待大鼠上肢及颈部明显僵硬，断头器断头开颅取脑，在冰块托盘内进行取材。

1.7 检测伊文思蓝含量(Evens blue，EB)反映血脑屏障通透性

图1显示，冠状位切取针孔后约3 mm脑组织，沿矢正中线切分出血侧与未出血侧，称重后放入组织匀浆器中，加入1.5 ml PBS液，将脑组织制成匀浆液，离心机4 ℃，2000 r/20 min，取上清1 ml加入1 ml 100%三氯乙酸，4 ℃孵育 24 h后，2000 gr/20 min。取上清液200 μl移入酶标板，用酶标仪测620 nm处吸光值(OD值)。EB标准曲线绘制：配置空白对照液(1 ml PBS液：1 ml 100%三氯乙酸)及EB标准液，微量移液器取0.5%伊文思蓝0.1 ml加入0.4 ml空白对照液中配置成第一管液(1000 μg/ml)，取第一管液0.1 ml加入0.1 ml空白对照液配置成第二管液(500 μg/ml)，以此类推，每次稀释2倍，至第十四管液(0.122 μg/ml)。选择第九管至十四管液的OD值，绘制EB标准曲线，计算每克脑组织EB含量，结果以 μg/g表示(与血脑屏障通透性呈正相关)。

图1 伊文思蓝含量标准曲线( μg/ml)

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 神经功能缺损情况

造模后假手术组大鼠无神经功能缺损体征，模型组及各给药组大鼠出现反应迟钝、摄食和自由活动减少及神经功能缺损体征。大鼠造模清醒1 h后偏瘫体征明显，表现为左前肢蜷缩不能完全伸展或长拖，行走向一侧转圈或向偏瘫侧倾倒等。评分1分的大鼠，术后1～2 d偏瘫体征稳定后逐渐改善。模型组及低剂量组内评分2～3分的大鼠，术后2～3 d偏瘫体征加重，部分死亡，术后4 d后偏瘫体征逐渐改善。与模型组比较，中、高剂量组大鼠自主活动恢复较快，神经缺损症状较轻，大多数表现为左前肢不能完全伸展或长拖，无意识障碍及死亡。

2.2 出血侧脑组织EB比较

表1显示，与假手术组比较，模型组、低剂量组、中剂量组在各个时间点EB均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量组在6 h、3 d时EB升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低剂量组在6 h、3 d时EB降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中、高剂量组在3个时点EB均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠脑出血侧脑组织EB(μg/g)比较

注：与假手术组比较:aP<0.05；与模型组比较:bP<0.05；与低剂量组比较:cP<0.05；与中剂量组比较:dP<0.05

2.3 未出血侧脑组织EB比较

表2显示，与假手术组比较，模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组在各个时间点EB均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低、中剂量组在3 d时EB升高，差异有统计学意义(P<0.05)；在7 d时EB降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，高剂量组在6 h、3 d时EB升高，差异有统计学意义(P<0.05)；在7 d时EB降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠未出血侧脑组织EB(μg/g)的比较

注：与假手术组比较:aP<0.05；与模型组比较:bP<0.05；与低剂量组比较:cP<0.05；与中剂量组比较:dP<0.05

3 讨论

脑出血后脑水肿与BBB破坏[6]及其双向调节功能障碍[7]密切相关，而BBB是位于脑组织和外周血液之间的复杂细胞结构，能调节和保证大脑内环境的稳定[7]。BBB损坏后，其双向调节功能障碍会导致其通透性增加，水分容易进入脑内形成脑水肿。然而目前尚未发现具有改善BBB功能并调节其通透性的西药，因此探究具有多靶点、多方面、整体调节改善BBB功能以减轻脑出血后脑水肿的中药汤剂具有重要意义。

玄府起源于《黄帝内经》，亦有“汗空”“腠理”“气门”“鬼门”等称谓，金元医家刘完素在《素问玄机原病式》中提出：“玄府者，无物不有，人之脏腑，皮毛，肌肉，筋膜，骨髓，爪甲，至于世之万物，尽皆由之，乃气出入升降之道路门户也。”基于目前玄府理论的诸多研究，可以认为玄府是遍布全身的最为细小的微观结构，而其所具有的广泛性、微观性、开阖性和通利性均与BBB结构及功能有着明显的相关性。从“玄府-血脑屏障”的角度对脑出血后脑水肿进行中医病机分析，脑中气机逆乱是引发中风病的始动因素，玄府失司、开阖失常是中风病的基本病机，水瘀内停、玄府郁闭是导致后期病情加重的重要因素。

导师白雪继承全国名老中医王明杰“玄府理论”学术思想，根据多年的临床经验，以风药、虫类药组方“祛风通窍方[8]”论治脑病，并已获得较多的科研成果。根据“玄府以通为用”“以通为顺，以闭为逆”等原则，治以风药、虫类药开通玄府，则可减轻脑水肿。本实验化裁上方重用麻黄治疗脑出血，既源于玄府理论对麻黄的认识，亦借鉴祛外风药治疗中风的经验，如小续命汤。

肖农等[9]研究发现，麻黄碱可促进脑缺血大鼠中枢神经系统内多种神经递质的释放，提高参与神经元重塑的蛋白分子表达；麝香具有改善脑循环及抗炎的作用，其组分麝香酮能可逆性下调紧密连接蛋白Claudins家族基因表达[10]，使紧密连接结构疏松，开启BBB；水蛭治疗脑出血具有抗凝血酶、调节Claudin-5的表达[11]、改善BBB通透性的作用[12]。地龙能溶解体内血栓、抗自由基、保护内皮细胞[13]；全蝎具有抗凝、抗氧化作用；茯苓具有抗氧化、抗炎作用。吴启端等[14]发现，石菖蒲挥发油、β-细辛醚能明显提高BBB通透性,从而提高脑部的药物浓度。

实验结果显示，加减祛风通窍方能降低脑出血后出血侧BBB通透性，抑制脑水肿加重，并存在一定的量效关系。从现代药理研究分析，可能与麻黄、水蛭、地龙、全蝎抗凝血作用减少凝血酶的产生，减少基质金属蛋白酶激活，抗氧化、减少自由基的产生有关，亦与水蛭素提高紧密连接相关蛋白Claudin-5的表达，改善BBB的作用有关。研究还发现，脑出血后未出血侧的BBB通透性亦会升高，可能是脑出血后大量自由基、血管活性物质等循环到未出血侧脑组织导致的。此方能够使未出血侧BBB通透性在脑出血后的某段时期进一步升高，可能与石菖蒲、麝香酮下调Claudins蛋白的表达，致使紧密连接结构疏松、提高BBB通透性有关。因此，风药、虫类药组方开通玄府对脑出血后BBB具有双向调节作用，即一方面能降低病理性BBB通透性，另一方面能够使未出血侧BBB通透性在脑出血后某段时期进一步升高，但其开放作用可能属于病理状态与药理作用的共同结果。此开放作用能否促进药物进入脑组织以增强疗效，以及此双向调节作用是否与水蛭素、石菖蒲、麝香酮的“相反作用”有关，均需今后深入研究。