电刺激对牦牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白氧化特性的影响

2018-12-15崔文斌王妍张丽马纪兵余群力刘小波王惠惠

食品与发酵工业 2018年11期

崔文斌,王妍,张丽,马纪兵,余群力,刘小波,王惠惠

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州,730070)

牦牛是高寒地区特有的牛种，主要分布在高海拔、无污染的高山草原环境中[1]。牦牛肉具有高蛋白、低脂肪的特性，深受广大消费者喜爱[2]。蛋白质作为肉及肉制品中的主要成分，其对肉品的营养和感官品质具有重要作用[3]。蛋白质氧化已经成为食品化学领域中最新的研究问题之一[4]。肉与肉制品在成熟及贮藏过程中的氧化现象普遍存在，造成蛋白质氧化损伤主要是由脂肪氧化、金属离子及内源氧化剂等引起的氧化反应导致的[5]。氧化会导致蛋白质发生显著的变化[6]，氧化还会使肉品色泽变暗，持水性和嫩度下降，食用品质劣变，营养价值降低，消费者接受程度下降，被认为是影响肉类食用品质的重要因素之一[7]。

电刺激是指对屠宰后动物胴体，在一定的电压、频率下作用一定的时间的操作[8]。电刺激能够改善肉质微观结构[9]，并且加快内源酶对肌原纤维蛋白的水解[10]。同时电刺激还可以改善肉的色泽[11]。DRANSFIELD等[12]研究发现，电刺激处理在一定程度上改变了肉的时间-温度-pH值之间的关系，进而对蛋白酶的活性以及蛋白质的降解产生一定影响，同时加快了肌原纤维蛋白的降解速度，影响了肉的成熟速度。HO等[13]研究发现，低压电刺激后背最长肌产生了挛缩带，并加快了肌联蛋白、伴肌动蛋白、肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解速度。张先峰等[14]在研究电刺激对牛肉肌原纤维结构的影响中发现，电刺激会产生挛缩带，使肌纤维微观结构发生变化，从而确证了肉在宰后成熟期间嫩度改善的具体原因；孙清亮等[15]在电刺激对宰后牛肉肌原纤维蛋白降解的影响中指出，电刺激加快了肌钙蛋白-T的降解，缩短宰后成熟时间。随着电刺激技术的日趋成熟，电刺激技术由于其较普遍的适用性和高效性已经被国外很多肉牛屠宰企业应用到实际生产加工中[16]。宰后成熟过程中的电刺激处理，决定了胴体僵直的性质、肌纤维收缩的程度以及肉的嫩化程度，对肉的食用品质有显著影响[17]。但目前，对于牦牛肉电刺激后肌原纤维蛋白氧化变化的分析暂未见报道。

因此本研究对甘肃甘南公牦牛宰后采用电刺激和未电刺激2种方式处理后，取其背最长肌，在0～4 ℃条件下成熟0～14 d的过程中，测定肌原纤维蛋白羰基、总巯基、二硫键含量、表面疏水性、K-ATPase活性以及蛋白二级结构等指标，旨在探索电刺激对宰后牦牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白氧化特性变化的影响，以期为宰后牦牛肉成熟过程中品质控制和改善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

1.1.1 材料与试剂

选择甘肃甘南州健康无病的(36±6)月龄公牦牛12头，电刺激组和未电刺激组各6头，平均体重(300±50) kg。电刺激组牦牛经宰杀、放血后进行电刺激处理(输出电压21 V，额定功率50 W，时间90 s)，未电刺激组牦牛宰杀、放血后未经电刺激处理，每头牦牛宰后30 min内劈半，在其左半胴体现场采集背最长肌，当即采集0天样品，在0～4 ℃成熟1、2、3、5、7、14 d，在相应时间点取样待测。

三氯乙酸(TCA)、盐酸胍、乙酸乙酯、乙醇、KH2PO4、KCl、K2HPO4、Na2CO3、HCl、溴酚蓝、甘氨酸、KOH、CuSO4.5 H2O、四水合酒石酸钾钠、牛血清白蛋白(BSA)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)，天津市光复科技发展有限公司；SDS(十二烷基磺酸钠)、Tris、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫二硝基苯甲酸(DTNB)，美国Sigma公司。上述试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

XH-B型涡旋混合器,江苏康健医疗用品有限公司；HI 99163 N便携式pH测定仪,哈纳沃德仪器有限公司；TU-1810 紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司；TGL-24 MC高速台式冷冻离心机,长沙平凡仪器仪表有限公司；FSH-2A型高速分散器,上海启前电子科技有限公司；DKS 28水浴锅,上海双旭电子有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 肌原纤维蛋白的提取

参照PARK等[18]的方法进行测定。

1.2.2 羰基含量的测定

参考LEVINE等[19]的方法进行测定。

1.2.3 巯基含量的测定

总巯基参照KORCHAK等[20]的方法进行测定。

1.2.4 二硫键含量测定

二硫键按照THANNHAUSER等[21]的方法，进行测定。

1.2.5 K-ATPase活性

参照WELLS等[22]的测定方法。

1.2.6 表面疏水性测定

依据CHELH等[23]的方法进行测定。

1.2.7 圆二色谱法测定蛋白二级结构

参考WHITMORE等[24]的方法进行测定。

1.3 数据处理

以上每个处理重复3次，用Microsoft Excel 2010进行数据统计分析，采用SPSS 19.0统计软件用Duncan法对所有数据进行显著性分析(p<0.01)。

2 结果与分析

2.1 羰基含量

牦牛肉成熟过程中不同处理组肌原纤维蛋白羰基含量变化如图1所示。

图1 牦牛肉成熟过程中羰基含量的变化Fig.1 Changes of carbonyl content during the maturation of yak meat注：大写字母表示同一处理组内不同时间点组内含量差异极显著(p<0.01)；小写字母表示同一处理组内不同时间点组内含量差异显著性(p<0.05)；“*”表示2种处理在同一成熟时间点组间含量差异显著(p<0.05)，“**”表示2种处理在同一成熟时间点组间差异极显著(p<0.01)，下同。

羰基的形成是蛋白质发生氧化的一个最显著变化，羰基的浓度的高低可以评判蛋白质氧化的程度[25]。由图1可知，随成熟时间的延长，羰基含量呈现逐渐上升的趋势，电刺激组的羰基含量显著低于未电刺激组(p<0.05)。电刺激处理初期，电刺激组羰基含量为1.71 nmol/mg蛋白，未电刺激组羰基含量为2.018 nmol/mg蛋白，这可能是由于电刺激使牦牛肉蛋白中一些不稳定的羰基化合物降解引起的。当成熟至第14天时，电刺激组羰基值为4.15 nmol/mg蛋白，未电刺激组为6.35 nmol/mg蛋白(p<0.01)，与未电刺激组相比，电刺激组羰基含量少增加了2.2 nmol/mg蛋白(p<0.01)，蛋白氧化程度低于未电刺激组。

2.2 总巯基和二硫键

电刺激和未电刺激对牦牛肉肌原纤维蛋白中总巯基和二硫键含量的影响如图2和图3所示。

图2 牦牛肉成熟过程中巯基含量的变化Fig.2 Changes of Sulfhydryl Content during Yak Meat Mature

图3 牦牛肉成熟过程中二硫键含量的变化Fig.3 Changes of disulfide content during maturation of yak meat

蛋白质氧化会导致蛋白质中巯基交联形成二硫键，从而造成巯基含量的下降[26]。由图2、图3可知，电刺激处理初期，与未电刺激组巯基、二硫键含量(88.17、10.24 nmol/mg蛋白)相比，成熟3 d时未电刺激处理组的巯基显著降低了12.5%，二硫键含量分别显著增加了29.1%、21.9%、27.7%、9.2%、19.1%(p<0.05)。在成熟14 d内，各组巯基含量不断下降，二硫键含量不断生成，这可能是因为氧化导致蛋白结构伸展，从而使临近的巯基生成二硫键[27]。综合图2、图3显示电刺激导致蛋白氧化速率减缓，在同一成熟时间，电刺激显著影响了蛋白质中巯基的交联程度及形成的二硫键数量。

2.3 K-ATPase活性

电刺激和未电刺激对牦牛肉肌原纤维蛋白中K-ATPase酶活性的影响如图4所示。

图4 牦牛肉成熟过程中K-ATPase活性的变化Fig.4 Changes of K-ATPase activity during maturation of yak meat

ATP水解释放能量能够驱动肌肉的收缩，因而ATP酶的活性既可以作为肌球蛋白构象变化的一个指标，也是ATP消耗和肌肉收缩标志[28]。由图4可知，随着成熟时间的延长，电刺激组和未电刺激组牦牛肉K-ATPase活性均呈下降趋势，且电刺激组的K-ATPase活性下降程度较未电刺激组低。电刺激组成熟第3天时K-ATPase活性与未电刺激组差异极显著(p<0.01)。表明电刺激影响了牦牛肉成熟过程中K-ATPase活性的变化，减缓了牦牛肉成熟过程中蛋白氧化的程度。

2.4 表面疏水性

电刺激和未电刺激对牦牛肉肌原纤维蛋白中表面疏水性的影响如图5所示。

图5 牦牛肉成熟过程中表面疏水性变化Fig.5 Surface hydrophobicity changes during maturation of yak meat

由图5可知，随着成熟时间的延长，电刺激组和未电刺激组牦牛肉肌原纤维蛋白表面疏水性均呈先上升后下降趋势，电刺激组的表面疏水性较未电刺激组高。未电刺激组表面疏水性在牦牛肉成熟第7天与成熟第3天、第5天差异显著(p<0.05)，与成熟第0天、第1天和第14天差异极显著(p<0.01)。电刺激组表面疏水性在牦牛肉成熟第5天与成熟第1天、第2天、第3天和第7天的表面疏水性呈显著性差异(p<0.05)，与成熟第1天和第14天呈极显著差异(p<0.01)。蛋白质表面疏水性可用来衡量蛋白质的变性程度，表面疏水性的增加则说明它的变性程度增加[23]。该研究中发现，电刺激和未电刺激组的蛋白其表面疏水性均有显著的增加，且电刺激组表面疏水性高于未电刺激组。

2.5 蛋白二级结构

电刺激和未电刺激对宰后牦牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白二级结构的影响如表1所示。

氧化会导致肌原纤维蛋白结构展开，使得α-螺旋含量随着氧化程度的加深而逐渐降低。肌原纤维蛋白氧化程度不同，导致其α-螺旋含量的降低幅度也产生差异。轻度氧化蛋白的降低量显著高于深度氧化蛋白[29]。对蛋白质二级结构通过曲线拟合的方法进行定量分析。表1为不同成熟时间过程中电刺激和未电刺激下牦牛肉肌原纤维蛋白的二级结构相对含量的变化情况。由表1可知，经过电刺激作用的影响，牦牛肉肌原纤维蛋白中的α-螺旋、β-折叠程度下降，而无规则卷曲比例升高；成熟时间越长，α-螺旋比例降低趋势越缓慢，由表1可以发现，成熟2 d的牦牛肉中α-螺旋比例显著低于成熟14 d的牦牛肉，结果会促进牦牛肉肌原纤维蛋白的复性[30]。α-螺旋结构在空间位阻上要比β-转角大，因此与α-螺旋和β-转角相比较，其氨基酸残基更容易受外加因素的影响[31]，在成熟2 d时，牦牛肉β-转角含量下降到最低。以上试验结果说明，蛋白质二级结构变性情况与电刺激作用可能有关。

表1 牦牛肉成熟过程中蛋白二级结构变化Table 1 Protein secondary structure changes duringmaturation of yak meat

注：小写字母表示同一处理组内不同时间点数据间差异显著性(p<0.05)，大写字母表示同一处理组内不同时间点数据间差异极显著(p<0.01)。

3 讨论

低压电刺激可以改变肉质微观结构[32]，使其肌节收缩、肌原纤维直径变小、肌原纤维小片化程度增大，同时加快内源酶对肌原纤维蛋白的水解[33]，提升品质，降低生产成本。有研究指出，电刺激使内源酶对蛋白质的降解速度减慢[34]，内源酶又会对蛋白氧化产生积极作用，由此，电刺激可能减缓了蛋白氧化的速度。

本研究发现，在成熟过程中，电刺激组牦牛羰基含量低于未电刺激组，且成熟至14 d时，电刺激组羰基含量4.15 nmol/mg蛋白极显著低于未电刺激组6.35 nmol/mg蛋白(p<0.01)，较未电刺激组低34.65%，表明电刺激可减少牦牛肉成熟过程中羰基的生成。电刺激组和未电刺激组牦牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白巯基含量均呈下降趋势，且电刺激组巯基含量较未电刺激组下降缓慢，表明在牦牛肉成熟过程中，电刺激会抑制巯基数量的减少，即对蛋白氧化有抑制作用，这与STADTMAN[35]对肉品蛋白氧化与成熟过程中的研究结果一致。本研究结果表明电刺激作用在短时间内显著改善牦牛肉肌原纤维蛋白的特性，这与李春强[29]研究的猪肉肌原纤维蛋白氧化程度中K-ATPase酶活性的变化结果一致。电刺激处理组显著的提高K-ATPase酶活性(p<0.05)，当K-ATPase被激活以后，随着宰后时间的延长，电刺激处理组的活性显著降低，但与对照组K-ATPase酶活性降低的速度相比，电刺激组K-ATPase酶活性降低的程度较大；蛋白质的表面疏水性是反映蛋白结构展开程度的重要指标，在牦牛肉成熟过程中，电刺激作用抑制了肌原纤维蛋白表面疏水性的增加，这与CHELH等[23]对猪肉肌原纤维疏水性测定中的研究结果一致。