不同剂量蔗糖铁诱导家兔绝经后铁蓄积模型的建立及机制初步探讨

邝立鹏　叶燕彬　江山岳　谢成龙　罗玉

【摘要】 目的：评估不同剂量蔗糖铁（iron sucrose，IS）通过耳缘静脉注射诱导家兔绝经后铁蓄积模型建立的可行性及对机制进行初步探讨。方法：普通级雌性家兔50只随机分为5组：假手术组、去勢组以及模型A、B、C组，各10只。去势组和模型组行双侧卵巢切除术，假手术组仅切除卵巢周围部分脂肪组织后即关闭腹腔。术后模型A、B、C组分别通过耳缘静脉注射不同剂量IS（10、15、20 mg/kg），假手术组和去势组以同样方式和频次给予适量生理盐水注射。分别于造模前1 d和造模后第8周比较各组血清铁蛋白（serum ferritin，SF）和17β-雌二醇（estradiol，E2）水平，分析去势组SF与17β-E2的相关性。结果：造模后第8周，模型A、B、C组SF水平均高于假手术组和去势组，且模型C组均高于模型A、B组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），去势组17β-E2水平低于假手术组（P<0.01），但两组SF水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）；去势组SF与17β-E2水平无相关性（r=-0.226，P=0.531）。结论：耳缘静脉注射IS可成功诱导家兔绝经后铁蓄积模型的建立，绝经后铁蓄积可能与机体铁排泄途径减少及摄入增多有关。

【关键词】 蔗糖铁； 家兔； 绝经后； 铁蓄积； 动物模型

Preliminary Study on Construction of Postmenopausal Ion Accumulation Rabbit Models Induced by Various Doses of Iron Sucrose and Mechanism/KUANG Lipeng，YE Yanbin，JIANG Shanyue，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（27）：0-033

【Abstract】 Objective：To evaluate the feasibility of constructing the postmenopausal ion accumulation rabbit models induced through injection with various doses of iron sucrose（IS） via the ear vein，as well as to preliminarily probe into the mechanism.Method：50 normal grade female rabbits were randomly divided into five groups：sham operation group，castration group and model A，B and C groups，10 rabbits in each group.The castration group and model groups were performed bilateral oophorectomy，while sham group was conducted removal of part of the adipose tissue around the ovary，followed by abdomen closure immediately.The model A，B and C groups were injected with various doses of IS（10，15 and 20 mg/kg） via the ear vein postoperatively respectively，and sham operation group and castration group were administered injection with appropriate amount of saline with the same method and frequency.The levels of serum ferritin（SF） and 17β-estradiol（E2） in each group were compared at 1 d before modeling and eighth weeks after modeling，the correlation between SF and 17β-E2 in castration group was analyzed.Result：Eighth weeks after modeling，the levels of SF in model A，B and C groups were higher than those of sham operation group and castration group，and the model C group was higher than model A and B groups，the differences were statistically significant（P<0.01），the level of 17β-E2 in castration group was lower than that of sham operation group（P<0.01），but the SF level of two groups was compared，the difference was not statistically significant（P>0.05）.There was no correlation between SF and 17β-E2 level in castration group（r=-0.226，P=0.531）.Conclusion：Injection with IS through the ear vein can induce the construction of the postmenopausal ion accumulation rabbit models，and the postmenopausal ion accumulation may be related to the reduced excretion pathways and increased intake of iron of the body.

【Key words】 Iron sucrose； Rabbit； Postmenopausal； Ion Accumulation； Animal models

First-authors address：The Fifth Affiliated（Zhuhai） Hospital of Zunyi Medical College，Zhuhai 519000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.27.008

铁离子是动物细胞必需的元素之一，参与多种细胞DNA合成、氧转运、细胞呼吸链氧化还原反应等。正常铁代谢构成机体的铁稳态，当铁稳态发生异常时，机体各类系统都会出现相应的代谢紊乱，其中铁过多会催化氧自由基形成，促使细胞膜发生脂质过氧化反应，导致细胞和组织损害，影响神经系统、血液系统[1]、肝脏系统等器官和组织的功能。近年来研究发现，铁蓄积还与绝经后骨代谢异常密切相关，健康绝经后女性骨密度下降与血清铁蛋白（serum ferritin，SF）水平存在相关性，铁蓄积是加速骨量丢失，促进骨质疏松发展的一个独立危险因素[2]。目前，国内外尚缺乏统一的绝经后铁蓄积动物模型，本研究拟通过蔗糖铁（iron sucrose，IS）家兔耳缘静脉注射增加铁的摄入，诱导绝经后家兔铁蓄积模型的建立及对机制进行初步探讨。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 雌性5月龄普通级新西兰兔50只，体重2.3～2.5 ㎏，购自广东省医学实验动物中心[SCXK（粤）2014-0035]。材料与器械由本院动物实验中心提供：常规消毒物品、生理盐水、3%戊巴比妥钠（麻醉剂）、庆大霉素、无菌纱布及敷料、缝合针及线、手术刀、持针器、血管钳、腹腔拉钩、普通眼科手术器械、镊子等；17β-雌二醇（17β-E2）放射免疫试剂盒、SF ELISA试剂盒：武汉贝茵莱生物科技有限公司；美国Thermo-ST16离心机：上海仁器仪器。

1.2 动物分组和模型的建立 （1）动物分组：50只新西兰兔随机分为5组：假手术组、去势组以及模型A、B、C组，各10只。（2）卵巢切除术：去势组和模型A、B、C组以3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉，在无菌条件下由耻骨联合上正中切口切开腹腔，手术切除双侧卵巢，关闭腹腔；假手术组打开腹腔找到卵巢后切除卵巢周围少许脂肪即关闭腹腔。术后均安置在饲养温度20～25 ℃，相对湿度为40%～70%的环境中。术后3 d内肌注庆大霉素

1万U/kg，2次/d。术后定量喂食（50 g/d），自由饮水。（3）注射IS：1周后模型组予耳缘静脉注射IS，模型A、B、C组剂量分别为10、15、20 mg/kg，每周2次，共8周。假手术组和去势组以同样方式和频次给予适量生理盐水注射。

1.3 观察指标 分别于造模前1 d和造模后第8周行耳缘静脉采血检测SF和17β-E2水平，分析去势组SF与17β-E2的相关性。

1.4 统计学处理 使用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）；采用线性相关分析相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 家兔一般情况 各组术前术后精神状态、活动及反应良好，无死亡。模型A、B、C组均未出现动物因注射过量IS而死亡的情况。

2.2 各组SF、17β-E2水平变化 造模前1 d，各组SF、17β-E2水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）；造模后第8周，模型A、B、C组SF水平均高于假手术组和去势组，且模型C组均高于模型A、B组，比较差异均有统计学意义（P<0.01）；造模后8周，去势组17β-E2水平低于假手术组（P<0.01），但两组SF水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1、2和图1。

2.3 SF与17β-E2水平的相关性分析 造模后第

8周，去势组的SF与17β-E2水平无相关性（r=-0.226，P=0.531）。

3 讨论

临床上，IS注射液成人的治疗剂量为2～3 mg/kg，根据体表面积折算法[3]，算出家兔的等效剂量为6.17～9.25 mg/kg，为了达到铁蓄积的目的，本研究三种不同剂量模型组分别采用10、15、20 mg/kg作为诱导剂量。

目前关于铁蓄积的研究对象大多为大鼠，但由于大鼠骨皮质内缺乏哈佛氏系统，无哈佛氏重建，故大鼠不适合作为研究铁蓄积对皮质骨影响的研究动物[3]。此外，大鼠体积小，不易多次采集骨活检标本及大量血液标本。鉴于铁蓄积与绝经后骨代谢异常，特别是与骨质疏松的形成有关，而骨质疏松症最严重的后果是骨折。张林林等[4]的研究发现，绝经后髋部骨质疏松性骨折患者普遍存在铁蓄积现象。铁蓄积与骨质疏松性骨折关系的研究中将家兔作为研究对象，可能有以下优势[5]：（1）兔性成熟后骺板闭合与人类相似，具有明显的哈佛氏重建能力，有利于皮质骨结构的观察；（2）兔骨骼转化约为人的3倍，可在短期内观察骨折愈合时骨组织的变化；（3）耳缘静脉采血和注射药物方法简便；

（4）家兔四肢骨属于长骨，结构与人类相似度较高。综上，建立家兔绝经后铁蓄积动物模型对研究女性绝经后铁蓄积相关的疾病，特别是关于骨质疏松症的研究具有重大意义。

临床反应铁稳态的指标主要是SF。SF可结合

4 500个铁原子，能较好地反映铁贮存能力。男性SF含量通常为15～200 μg/L，女性则为12～150 μg/L；

当人体SF含量>1 000 μg/L时，被认为是病理性铁过载，需要临床降铁治疗；而当人体SF含量高于正常值但<1 000 μg/L时，则被认为存在铁过多（铁蓄积），目前暂时没有临床干预方案[6]。Wnt/β-catenin信号通路的抑制可造成成骨细胞功能的障碍，从而抑制骨形成[7]。铁蓄积状态下，机体内铁离子可通过芬顿（Fenton）反应产生更多活性氧自由基，可催化氧化应激反应，研究表明，氧化应激反应可以通过抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路，抑制骨形成，促进骨吸收，导致骨质疏松症[8-9]。近年来研究报道，减少体内铁含量是预防铁蓄积导致的骨質疏松症的一种方法[10-11]。目前国内外尚未有统一标准的绝经后铁蓄积动物模型，因此本研究在参考国内外相关文献[12-16]的基础上，设计了本实验方案：予去势后家兔耳缘静脉注射大剂量IS注射液诱导铁蓄积。临床上该药主要用于正在补充促红细胞生成素的需长期血液透析的患者的缺铁性贫血治疗，毒性极低，但用药过量会导致急性铁过载。通过定期注射IS 8周后检测SF水平对IS的注射剂量进行考察，结果显示耳缘静脉注射不同剂量IS注射液（10、15、20 mg/kg）后，各组家兔的SF水平均较去势前升高，其中以模型C组（20 mg/kg）的SF水平升高最为显著，明显高于同期假手术组、去势组及模型A、B组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。研究结果表明家兔通过耳缘静脉注射IS，增加铁的摄入，可诱导家兔绝经后SF水平的升高，这也证明了本研究方法能成功诱导家兔绝经后铁蓄积模型的建立。

更年期是女性生殖能力結束的时期，一般发生在45～54岁，处于此年龄段的女性卵巢活动减少，雌激素停止生产。体内雌激素以雌酮、17β-E2、雌三醇三种形式存在，其中E2活性最强，雌酮和

E2可以在血中互相转化，维持动态平衡。其中雌三醇是雌酮和E2的代谢产物，生物活性非常弱，

E2是反应雌激素水平的主要指标之一。无论是何种生物，在生理状态下都缺少排泄铁的机制，而正常女性一年经过月经宫血可排出大约36 mg铁，绝经后女性由于失去了上述铁排泄途径，容易造成铁在体内的积累，因此铁蓄积在绝经后女性中多见。一项临床观察研究发现：雌激素缺乏与铁蓄积密切相关，当雌激素较正常水平降低90%时，绝经后SF水平可较绝经前增加2～3倍[17-18]。该研究表明，随着围绝经期雌激素的逐渐衰退，出现了停经，铁开始在体内积累，铁蓄积程度随着雌激素的减少而逐渐加重。但由于铁稳态主要接受铁调素（hepcidin）的调节[19]，而雌激素可抑制hepcidin的表达，当缺乏雌激素时，机体hepcidin的表达水平升高，可抑制机体对铁的吸收，进而维持铁稳态[20-21]，当hepcidin表达过高时，甚至还会出现缺铁的情况[22]。本实验结果也发现：造模后第8周，去势组17β-E2水平低于假手术组（P<0.05），但两组SF水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；且去势组造模后第

8周的SF与E2水平无相关性（P>0.05）。上述结果提示，雌激素的下降并不能引起铁含量的增加，绝经后铁含量与雌激素之间无相关性。因此，本研究初步推测：女性雌激素缺乏并不是引起铁蓄积的直接原因，可能与绝经后停止宫血排铁有关，铁蓄积的形成可能主要与机体铁排泄途径的减少及摄入增多有关，目前仍需进一步研究证实。

综上所述，因雌激素缺乏并不是引起铁蓄积形成的原因，且雌激素缺乏可促进hepcidin的表达，抑制对铁的吸收，故仅通过去势法减少铁的排泄途径不利于短期内建立动物铁蓄积模型。本实验通过去势法结合注射过量IS，增加动物绝经后铁的摄入量，成功建立了家兔绝经后铁蓄积模型，且该模型的建立遵循绝经后铁蓄积的形成原理，能较好地模拟女性绝经后铁蓄积的发生发展，再加上家兔作为研究绝经后骨质疏松症的优势，是比较适合广泛应用的绝经后铁蓄积动物模型。

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（收稿日期：2018-05-21） （本文編辑：董悦）