宫炎净提取物中生物碱对子宫内膜炎家兔的抗炎作用机理

贾书红　李效振　张东升　等

摘要：为研究中药复方宫炎净提取物中生物碱对子宫内膜炎家兔的抗炎作用机理，通过制备子宫内膜炎家兔模型，给予不同剂量的生物碱治疗后采血，分别对血液中超氧化物歧化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）含量，白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达水平进行测定。结果表明，中药复方宫炎净中生物碱能显著增强血清中SOD活性，并显著或极显著降低血清中MDA、NO、IL-2、IL-6及TNF-α含量（P<0.05或P<0.01）。以上结果表明，生物碱能降低子宫内膜炎家兔脂质过氧化物含量，提高机体的抗氧化能力，降低机体炎性细胞因子含量，降低机体损伤。

关键词：生物碱；家兔；子宫内膜炎模型；抗炎机理

中图分类号： S853.74文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0209-03

收稿日期：2014-03-24

基金项目：新疆生产建设兵团科技支疆项目（编号：2013AB010）。

作者简介：贾书红（1989—），女，河北石家庄人，硕士研究生，从事中草药的开发与利用研究。E-mail：jiashuhong16@163.com。

通信作者：谷新利，男，教授，博士生导师，从事中草药的开发与利用研究。E-mail：xlgu@shzu.edu.cn。奶牛子宫内膜炎是子宫内膜发生炎症的病理过程[1]，在临床上治疗该病大多依赖抗生素，而使用抗生素会带来细菌耐药性、药物残留等问题，迫使人们越来越倾向使用中草药治疗奶牛子宫内膜炎[2-4]。近年来，对于中草药治疗该病的报道较多，且对中草药的抗炎作用也进行了大量研究，但对中草药治疗奶牛子宫内膜炎的机理鲜有报道。研究人员依据中药复方配方原则将益母草、五灵脂、红花、肉桂等中药组合研制开发的中药复方宫炎净用于治疗奶牛子宫内膜炎，并在临床上取得较好的治疗效果[5]。本试验目的是从中药抗氧化以及对细胞因子影响方面观察中药复方宫炎净提取物中生物碱对子宫内膜炎家兔模型血液中一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）、丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）活性以及细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α表达水平变化，旨在初步探讨中药复方宫炎净提取物中生物抗炎作用机理。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验药物中药复方宫炎净主要有益母草、当归、川芎、桃仁、五灵脂、甘草等组成，由石河子大学动物科技学院中兽医实验室提供。中药复方宫炎净提取物：取中药复方宫炎净2 kg，加入10倍量70%乙醇浸泡24 h，装柱，以2 mL/s的速度渗漉48 h，收集渗漉液，于旋转蒸发器浓缩至生药含量为1 g/mL。将制备好的宫炎净提取液，用稀盐酸调pH值4～5，抽滤，通过已处理好的阳离子交换树脂柱，至流出液与10%硅钨酸呈阳性反应为止。先用去离子水洗至流出液为近中性，再以5%盐酸溶液洗脱至生物碱反应为阴性。收集洗脱液，蒸干即得生物碱。将生物碱溶于蒸馏水中，配成质量浓度为0.04 g/mL的溶液。

1.1.2试验动物健康无生殖疾病的未孕新西兰雌兔，体质量2.0～2.5 kg，由石河子大学试验动物中心提供。家兔子宫内膜炎模型制作[6]： 取30只新西兰雌兔，饲喂1周后，随机分组，其中5只作为正常对照组，其余25只作为试验组，试验组家兔子宫灌注大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的12 h培养物等比例混合菌液2 mL/（只·d），每天1次，连续4 d。通过观察家兔临床症状、体温变化、子宫分泌物变化、白细胞分类变等确认造模成功后用于试验。

1.1.3主要试剂与仪器地塞米松磷酸钠注射液（1206091，河南润宏制药有限公司）；冰醋酸为国产分析纯；NO测试盒（硝酸还原酶法，20130824）、SOD测试盒（羟胺法，20130820）、MDA测试盒（硫代巴比妥酸法，20130823）均购于南京建成生物工程研究所；IL-2、IL-6、PGE2与TNF-a ELISA测定试剂盒均购于美国RD公司。 BioTek SynergeyTM 2多功能酶标仪 （550，Bio-Rad）；TDL-5离心机（Z36 HK，上海安亭科学仪器厂）；电热恒温水浴箱（WB-3-2.0T，上海实贝仪器设备厂）；涡旋混匀器。

1.2方法

将25只造模成功的新西兰母兔随机分成5组，每组5只，分别为中药高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组和地塞米松组。中药高中低3个剂量组分别给予生物碱（10、5、2.5 mL/只）；地塞米松组给予地塞米松，剂量为 5 mg/kg；模型组不予治疗；正常对照组给予生理盐水。给予频率1次/d，连续7 d。

样品采集和处理。各组家兔于末次给药后，分别心脏采血约10 mL，室温下静置1 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清于-20 ℃保存待用，用以SOD活性，MDA、NO、PGE2含量以及IL-2、IL-6、TNF-α表达水平的测定。

1.3检测指标

1.3.1家兔SOD活性及MDA、NO、PGE2含量测定SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法（TBA），NO含量的测定采用硝酸还原酶法，PGE2含量的测定采用双抗体夹心法。严格按照试剂盒使用说明测定，并根据相应计算公式计算出试验结果。

1.3.2家兔血清中IL-2、IL-6、TNF-α表达水平的测定IL-2、IL-6、TNF-α表达水平的测定均采用双抗夹心法。测定原理为双抗体夹心法的基本原理，即利用特异性抗体包被微孔板，制成固相抗体，然后和待检血清中相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后加酶标抗体，与免疫复合物中抗原结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经彻底洗涤后加底物显色。用酶标仪在450 nm处测吸光度，通过标准曲线计算样品浓度。

1.4数据处理

试验数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，试验结果均以“平均数±标准差”表示。

2结果与分析

2.1家兔血清中SOD活性以及MDA含量的测定

由表1可见，子宫内膜炎家兔模型组血清中SOD的活性以及MDA的含量均极显著低于空白对照组。生物碱高剂量组SOD活性极显著强于模型组；生物碱中剂量组和低剂量组SOD活性均显著强于模型组；生物碱高、中、低3个剂量组均与空白对照组差异不显著，且均与地塞米松组差异不显著；生物碱高、中、低3个剂量组间无显著差异。而子宫内膜炎家兔模型组血清中MDA含量除显著高于生物碱低剂量组外，均与其他组差异极显著。生物碱高、中、低3个不同剂量组MDA含量均与空白对照组差异不显著，且均与地塞米松组差异不显著。表明中药复方宫炎净中生物碱能显著增强血清中SOD活性，降低MDA含量，提高机体抗氧化能力，降低机体损伤。

2.2家兔血清中NO、PGE2含量的测定

由表2可见，子宫内膜炎家兔模型组血清中NO含量极显著高于空白对照组；生物碱高剂量组和中剂量组NO含量均极显著低于模型组，均与地塞米松组差异显著，且均与空白对照组差异不显著；生物碱低剂量组NO含量显著高于生物碱高剂量组和中剂量组。而家兔血清中PGE2含量变化不明显。表明生物碱能显著降低子宫内膜炎家兔血液中NO含量。

表1家兔血清中SOD活性以及MDA含量测定结果（n=5）

表2家兔血清中NO、PGE2含量测定结果（n=5）

组别NO含量

（μmol/L）PGE2含量

（ng/L）生物碱高剂量组58.07±0.52bBC347.62±17.12生物碱中剂量组61.93±7.98bBC385.79±22.53生物碱低剂量组83.45± 10.23aAC 360.43±21.82地塞米松组53.24±4.69bB364.63±19.60模型组92.69± 6.92aA 384.95±24.02空白对照组52.83±5.08bB377.11±16.87

2.3家兔血清中IL-2、IL-6、TNF-α表达水平测定

由表3可见，子宫内膜炎家兔模型组的IL-2、IL-6、TNF-α含量与均极显著高于空白对照组。生物碱高剂量组的IL-2与IL-6表达水平均与模型组差异极显著，与地塞米松组差异不显著，且与空白对照组差异不显著；而生物碱中剂量组的IL-2与IL-6的表达水平均显著低于模型组，且与空白对照组和地塞米松组差异不显著；生物碱低剂量组 IL-2 与IL-6含量均与模型组差异不显著；生物碱高、中、低3个剂量组之间均差异不显著。模型组TNF-α的表达水平与生物碱低剂量组差异显著，与其他各组均差异极显著；生物碱高、中剂量组与地塞米松组均差异不显著，且均与空白对照组均差异不显著。生物碱高、中、低3个剂量组TNF-α水平的表达之间差异不显著。表明生物碱能显著降低血液中IL-2、IL-6、TNF-α的表达水平，且以生物碱高剂量组效果最好。表3家兔血清中IL-2、IL-6与TNF-α表达水平测定结果（n=5）

组别IL-2表达水平

3结论与讨论

正常状态下，机体内抗氧化能力始终与机体清除自由基之间维持动态平衡，以维持机体内环境稳定保护机体组织不被损伤。近年研究结果表明，机体许多疾病如炎症、自身免疫疾病等均与机体内过量的氧自由基有关，即机体抗氧化能力下降或氧自由基产生过多则会引起组织损伤[7]。正常情况下，体内产生的氧自由基不仅无毒性作用，还具有独特的生理作用，能杀灭有害微生物、消灭突变的细胞、解毒以及免疫调节等作用。但如果体内氧自由基产生过多或机体清除氧自由基的能力降低之后，能引起氧自由基蓄积引起组织损伤。SOD在机体组织内广泛存在，是机体重要的抗氧化酶，能保护细胞免受自由基损伤，SOD活性间接反映机体清除自由基的能力。MDA是机体脂质过氧化反应的终末代谢产物，机体内MDA含量常可以反映机体脂质过氧化状态，从而可以间接反映机体受氧自由基攻击的严重程度。本试验结果显示，子宫内膜炎家兔模型组血清中SOD活性显著减弱，MDA含量显著升高；而中药复方宫炎净中生物碱能显著增强血清中SOD活性，降低MDA含量。表明子宫内有炎症时机体MDA含量显著升高，体内氧化过程加剧自由基产生过多，此时SOD活性显著减弱，机体抗氧化能力显著下降，最终导致机体抗氧化能力与清除自由基之间动态平衡被打破，引起机体损伤。而生物碱能提高机体抗氧化能力，降低机体损伤，这与郭宏斌等的报道[8-9]一致。

NO是一种具有不配对电子的自由基，能与超氧阴离子反应生成强氧化性物质—过氧化亚硝酸盐，这种强氧化性物质不仅具有毒性，导致脂质过氧化，而且还能进一步产生多种毒性物质，引发组织损伤，在炎症的发生及发展过程中起重要作用[10]。PGE2是花生四烯酰合成酶的代谢产物，由巨噬细胞分泌合成，是一种重要的炎性介质，在局部炎症和骨关节炎中研究较多[11-14]。本试验结果显示，子宫内膜炎家兔模型组血清中NO含量显著升高，且生物碱能显著降低血清中NO含量，而各组血清PGE2含量均变化不明显。表明NO参与机体炎症过程，导致细胞损伤，而生物碱能降低NO的生成，起到抗炎作用；PGE2可能在局部炎症中生成会增多，但在子宫内膜炎家兔血清中变化不显著，说明生物碱对家兔子宫内膜炎的抗炎机理可能与抑制NO生产有关，与李晓红等的研究结果[15-16]一致。

细胞因子主要是指由免疫细胞和非免疫细胞分泌的一类小分子多肽或蛋白质。细胞因子根据Th细胞亚群分泌特点将其划分为2种：Th1型和Th2型细胞因子。前者主要包括IL-2、IFN-γ以及TNF-β，主要参与细胞介导免疫；后者主要包括IL-4、IL-5、IL-6、IL8以及IL-10，参与体液介导免疫。在机体发生炎症、变态反应、休克或自身免疫疾病时，某些细胞因子的表达量会大量增加。 IL-2主要由Th1细胞产生，可诱导T细胞增殖，诱导NK细胞和LAK细胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子，活化巨噬细胞[17]，但在生殖免疫方面，因IL-2不利于胚胎生产，被认为是有害的细胞因子。IL-6 是由多种淋巴细胞和淋巴细胞产生的一种糖蛋白，生物活性多种多样，参与机体炎症反应。TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，其生物活性十分广泛，对机体免疫反应、炎症反应及代谢具有重要的调节和介导作用。张冬波研究发现，子宫内膜炎的轻重程度与炎性细胞因子水平有关，奶牛发生子宫内膜炎后，子宫内膜炎组织中IL-2、IL-6、TNF-α的水平均高于正常奶牛[18]。赵广兴等用混合菌接种法制作慢性盆腔炎动物模型，发现模型输卵管局部组织中IL-2 和 IL-6 水平显著增高[19]。叶赞等通过建立大鼠产后子宫炎症模型，发现模型组血清中TNF-α水平显著升高，益母草能使血清中TNF-α水平显著下降[20]。本试验结果显示，子宫内膜炎家兔模型组血清中IL-2、IL-6与TNF-α表达水平均显著高于空白对照组，生物碱能显著降低家兔血清中IL-2、IL-6、TNF-α表达水平，与上述报道一致。

参考文献：

[1]佘锐萍. 动物病理学[M]. 北京：中国农业出版社，2007：607-609.

[2]倪鸿韬，王瑜. 复方杨黄灌注液对奶牛子宫内膜炎的药效试验[J]. 中国草食动物，2011，31（3）：76-77.

[3]李世宏，严作廷，谢家声，等. “清宫液2号”治疗奶牛子宫内膜炎试验研究[J]. 中兽医医药杂志，2009，28（6）：32-33.

[4]冀红，侯晓明，廖磊. 复方益母草膏药效学实验研究[J]. 首都医药，2006，8（14）：42-43.

[5]李正国.抗奶牛子宫内膜炎复方中药的药理作用研究[D]. 石河子：石河子大学，2009.

[6]孔祥峰，胡元亮，郭振环，等. 家兔子宫内膜炎模型的建立和临床病理学观察[J]. 中国实验动物学报，2006，14（3）：213-216，封三.

[7]Andreoli S P. Reactive oxygen molecules，oxidant injury and renal disease[J]. Pediatric Nephrology，1991，5（6）： 733-742.

[8]郭红斌，弓素梅，全军，等. 加味益母生化栓治疗奶牛子宫内膜炎的研究[J]. 中国兽医杂志，2008，44（2）：49-50.

[9]李德军，郭定宗，裴小英.子宫内膜炎奶牛产后氧化损伤与抗氧化变化[J]. 中国畜牧兽医，2010，37（4）：174-177.

[10]Kasimanickam R，Duffield T F，Foster R A，et al. Endometrial cytology and ultrasonography for the detection of subclinical endometritis in postpartum dairy cows[J]. Theriogenology，2004，62（1/2）： 9-23.

[11]邓琪，黄美景，郭丽冰，等. 三丫苦抗炎镇痛作用及机制研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2011，17（4）：125-128.

[12]许伟朋. TNF-α、PGE2和MMP-9在膝骨关节炎滑膜中的表达及意义[D]. 郑州：郑州大学，2012.

[13]吴红娟，孙必强，朱传湘，等. 盐酸青藤碱对家兔骨关节炎关节液IL-1β、PGE2生成与关节组织结构的影响[J]. 湖南中医药大学学报，2010，30（9）：84-86.

[14]王力民，汤慧. 骨性关节炎患者关节囊滑液MMP-3、PGE2检测的临床意义[J]. 放射免疫学杂志，2010，23（1）：59-61.

[15]李晓红，齐云，蔡润兰，等. 甘草总皂苷抗炎作用机制研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2010，16（5）：110-113.

[16]韩召敏，华小黎，吕永宁，等. 拔葜抗炎作用及对炎症介质的影响[J]. 中华中医药学刊，2008，26（2）：295-297.

[17]金伯泉，金伯泉. 细胞和分子免疫学[M]. 西安：世界图书出版西安公司，1995：95-135.

[18]张冬波. 奶牛子宫内膜炎组织相关因子的研究[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2006.

[19]赵广兴，马宝璋，袁家麟. 慢性盆腔炎输卵管病理与IL-2 IL-6的关系[J]. 辽宁中医杂志，2003，30（9）：704-705.

[20]叶赞，王若光. 益母草对产后子宫内膜炎大鼠内膜止血修复的实验研究[J]. 药物评价研究，2012，35（4）：246-249.黄勇，吴德华，宋珍华，等. 德国牧羊犬与史宾格犬性情行为的比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：212-213，223.