苏格木勒-3汤水提物中镇静催眠成分的筛选

萨础拉,朝木日丽格,韩金美,王树梅

(内蒙古医科大学,呼和浩特 010110)

失眠是一种影响健康的常见疾病。随现代社会经济的高速发展、生活节奏不断加快，失眠日益成为困扰人们身心健康的隐患杀手。蒙医理论认为，引起失眠的原因有外因及内因两种。外因有劳逸失调、受到惊吓、思虑过多等；内因是体内“赫依”增多紊乱，使“三根”失调，引起心、脑、肾、血管、神经相关疾病，从而导致失眠[1]。蒙药苏格木勒-3汤为蒙医临床常用主治失眠的方剂，始载于《四部医典》[2]。其味辛，性温，具有抑赫依作用，主治失眠。由白豆蔻15 g、香旱芹10 g、荜茇5 g组成。白豆蔻为主药，味辛、苦，性温，蒙文名为苏格木勒，可祛肾寒、镇赫依、温中消食，主治肾赫依病、失眠、消化不良等[3]。香旱芹为辅药，味辛、性平，具有清肺热、提升胃火、消食的功效[3]。荜茇为佐药，有抑赫依、调理体素、化痰、止痛等功效，味辛，性温、腻[3]。但苏格木勒-3汤中治疗失眠的主要有效成分目前尚不明确。5-羟色胺(5-HT)、神经递质γ-氨基丁酸(GABA)、白细胞介素1-β(IL-1β)是常用的失眠指标。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)是临床常用的氧化损伤指标。2018年3月～2018年4月，我们通过建立对氯苯丙胺酸 (PCPA)大鼠失眠模型，观察苏格木勒-3汤水提物对失眠模型大鼠脑组织5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA的影响，苏格木勒-3汤水提物中具有镇静催眠效果的有效物质。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 药品、动物及仪器 白豆蔻、香旱芹与荜茇购自内蒙古天立药材公司，经内蒙古医科大学蒙医药学院图门巴雅尔教授鉴定为正品。SPF级SD大鼠102只，体质量180～220 g，雌雄各半，分笼饲养，购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂，合格证号：11401300076603，许可证：SCXK(京)2014-0004。阿普唑仑片(江苏恩华药业股份有限公司，批号：H32020215，规格：0.4 mg/片)；0.9%生理盐水(山东科伦药业有限公司，批号：H37022918)；PCPA(美国Sigma公司，规格：25 g)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，纯度：≥99.5%，批号：20171211)。Rat5-HT试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司，批号：20180425)；Rat GABA试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司，批号：20180425)；IL-1β试剂盒(联科生物技术股份有限公司，批号：2301b71122)；SOD测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：A001-1)；MDA测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：A003-1)。

DL-1型电炉(北京永光明医疗器械有限公司)；BS323S型电子天平(北京赛多利斯科技仪器有限公司)；FW135型中草药粉粹机(天津华新仪器厂)；药用筛(南京科达仪器厂)；全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，美国Thermo公司)；电热恒温培养箱(天津泰斯特；DH4000A)；MINI shaker(MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER)；自动洗板机、离心机(美国Thermo公司)；电动匀浆器(FLUKO、F6/10model)。

1.2 苏格木勒-3汤水提物的制备 分别称取苏格木勒-3汤(白豆蔻∶香旱芹∶荜茇=3∶2∶1)50 g、白豆蔻∶香旱芹(3∶2)42 g、白豆蔻:荜茇(3∶1)33 g、香旱芹∶荜茇(2∶1)25 g、白豆蔻25 g、香旱芹17 g、荜茇8 g加1 000 mL蒸馏水，煎煮30 min后，滤过，滤液蒸干，制作苏格木勒-3汤水提物、白豆蔻-香旱芹水提物、白豆蔻-荜茇水提物、香旱芹-荜茇水提物、白豆蔻水提物、香旱芹水提物、荜茇水提物，得率分别为18%、17%、20%、32%、11%、37%、29%。按得率计算最终给药量。

1.3 大鼠分组与失眠模型制备 取102只大鼠，随机分为空白组、模型组、阳性组、苏格木勒-3汤水提物高及低剂量组、白豆蔻-香旱芹水提物高及低剂量组、白豆蔻-荜茇水提物高及低剂量组、香旱芹-荜茇水提物高及低剂量组、白豆蔻水提物高及低剂量组、香旱芹水提物高及低剂量组、荜茇水提物高及低剂量组等17组，每组6只。除空白组外，剩下16组大鼠适应性喂养7 d，每天上午8:00～9:00腹腔射注300 mg/kg的PCPA混悬液(生理盐水溶解，pH 7～8)，每天1次，连续注射2 d，制作大鼠失眠模型。2天后，与空白组比较，其他组大鼠出现昼夜节律紊乱，白天活动不停，毛发杂乱，兴奋性增强，攻击性增强，大便灰白等显著的行为学改变，表明大鼠失眠模型成功[4]。

1.4 苏格木勒-3汤水提物给药方法 空白组、模型组大鼠每天生理盐水灌胃，阳性组予阿普唑仑0.09 mg/kg灌胃，苏格木勒-3汤水提物高及低剂量组分别予108、54 mg/kg的苏格木勒-3汤水提物灌胃，白豆蔻-香旱芹水提物高及低剂量组分别予84、42 mg/kg的白豆蔻-香旱芹水提物灌胃，白豆蔻-荜茇水提物高及低剂量组分别予82、41 mg/kg的白豆蔻-荜茇灌胃，香旱芹-荜茇水提物高及低剂量组分别予98、49 mg/kg的香旱芹-荜茇水提物灌胃、白豆蔻水提物高及低剂量组分别予33、16.5 mg/kg的白豆蔻水提物灌胃、香旱芹水提物高及低剂量组分别予74、37 mg/kg的香旱芹水提物灌胃、荜茇水提物高及低剂量组分别予29、14.5 mg/kg的荜茇水提物灌胃，1次/d，连续灌胃7 d。

1.5 各组大鼠脑组织5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA检测 末次灌胃后，将各组大鼠断头处死，迅速取出大鼠大脑组织，生理盐水冲洗后称重，按组织重量，加入10%生理盐水组织用电动匀浆器匀浆。4 ℃，3 500 rpm离心10 min后取上清液，于-20 ℃或-80 ℃低温保存。采用ELISA法检测各组大鼠脑组织5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA，测定各组450 nm处光密度(OD值)，并代入标准曲线方程式，计算出各组大鼠脑内5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA含量。

2 结果

各组大鼠脑组织5-HT、GABA、IL-1β含量比较见表1。

表1 各组大鼠脑组织5-HT、GABA、IL-1β含量比较

注：与空白组比较,△P<0.05；与模型组比较,*P<0.05。

各组大鼠脑组织SOD、MDA含量比较见表2。

3 讨论

目前实验研究中制作失眠模型的方法有电刺激法[5]、水平台法、PCPA法。电刺激法最是通过电流刺激改变大鼠的睡眠-觉醒节律。水平台法主要阻断大鼠REM睡眠[6]，剥夺大鼠的深睡眠。前两种方法由于成本高，耗时较长，模型质量不稳定，对实验结果影响较大。有研究[7]报道，腹腔注射PCPA建立失眠模型的动物，在给药后第3～6天动物失眠状态最明显，第7天开始失眠状态慢慢恢复，到第9天失眠状态基本消失，但此时脑内5-HT等相关的神经递质仍处于低水平。这是因为PCPA对TPH的抑制作用是不可逆的，需要待体内PCPA完全消失，并且有新的色氨酸羟化酶分子合成，5-HT才能缓慢恢复[8]。本实验中用连续2天为动物腹腔注射PCPA的方法建立失眠模型，于第1次腹腔注射PCPA后36 h，动物出现昼夜节律紊乱，兴奋性增强，睡眠消失等症状。本次实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠脑内5-HT、GABA含量均减少，与多数注射PCPA建立睡眠剥夺模型动物神经递质变化的文献[9,10]报道一致，表明造模成功。

表2 苏格木勒-3汤水提物各组对大鼠脑内SOD、MDA的影响

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

近年来研究[11]发现，神经递质5-HT、GABA、IL-1β在睡眠-觉醒节律过程中等起到重要作用；朱国庆等[12]发现选择性阻断脑内5-HT的合成，可致大鼠失眠；Sherin等[13]发现增加脑内GABA含量，可提高慢波睡眠质量；宋媛等[14]发现增加脑内IL-1β的含量，能治疗失眠。因而本研究考察了这三个指标，结果显示：苏格木勒-3汤水提物中白豆蔻、香旱芹、荜茇等水提物均可增加失眠模型大鼠脑内5-HT与GABA含量，说明苏格木勒-3汤水提物中镇静催眠作用的有效物质基础来源于各单味药。据赵翠仙等[15]等报道荜茇乙醇提取物有明显的抗戊四唑的惊厥作用。荜茇中的胡椒碱可明显减少大鼠得自主活动，具有一定的镇静作用。还可明显延长戊巴比妥钠诱发小鼠的睡眠时间。白豆蔻及香旱芹的镇静催眠作用还需继续深入研究。本研究结果显示，虽然苏格木勒-3汤水提物及各单味药有降低趋势但是作用并不明显，阳性对照药物阿普唑仑也没有起到作用。另一方面，苏格木勒-3汤水提物中白豆蔻、香旱芹、荜茇等水提物均可增加失眠模型大鼠脑内SOD含量，降低MDA含量，可不同程度显示出一定的抗氧化能力。这与冯雪等[17，18]研究发现白豆蔻精油和香旱芹黄酮具有良好的抗氧化效果的报道一致。

综上所述，苏格木勒-3汤水提物中镇静催眠作用的有效物质来源于白豆蔻、香旱芹、荜茇等单味药；白豆蔻、香旱芹、荜茇可通过降低脑组织MDA、升高SOD含量发挥震惊催眠作用。