HOX转录反义RNA在乳腺癌中的表达及意义

赵月鸣 董 莹 袁红梅 邢德君

(吉林省肿瘤医院，吉林 长春 130021)

含有丰富的长链非编码RNA是多细胞动物基因组的显著特点，长链非编码RNA是转录长度超过200nt的一类功能性RNA，其本身不编码蛋白，主要以RNA的形式在表观遗传学、转录及转录后调控等多个层面发挥调控基因的作用。长链非编码RNA在机体几乎所有的病理生理过程中发挥作用，和多种肿瘤的发生发展关系密切。HOX转录反义RNA(HOTAIR)存在于HOX基因中，是具有反式作用的长链非编码RNA，最近的研究发现，HOTAIR和肾癌、肝癌、卵巢癌、食管癌、直肠癌等多种恶性肿瘤的关系密切〔1，2〕，HOTAIR在乳腺癌发生发展中的作用也被不少研究证实：HOTAIR在乳腺癌血浆和乳腺癌组织中的表达水平升高，能够抑制乳腺癌细胞增殖，促进乳腺癌细胞凋亡等〔3～5〕。本文对乳腺癌组织中HOTAIR和其调控基因HOXD10的表达情况及HOTAIR基因的甲基化情况进行研究，探讨HOTAIR基因在乳腺癌发生发展中的可能机制。

1 资料与方法

1.1标本来源 选择2017年1～12月吉林省肿瘤医院普外科和乳腺外科45对手术切除乳腺癌组织、正常癌旁组织、前哨淋巴结组织、腋窝淋巴结组织，乳腺癌组织均病理诊断为乳腺浸润性癌；前哨淋巴结组织病理证实有2枚以上乳腺癌转移；癌旁组织和腋窝淋巴结组织均病理诊断为正常乳腺组织和腋窝淋巴结组织。45例标本均来源于女性患者，平均年龄(41.3±4.2)岁，肿瘤大小(3.4±1.2)cm，肿瘤分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期27例、Ⅲ期8例，Ki-67 为(38.4±21.3)%，孕激素受体(PR)阳性30例，雌激素受体(ER)阳性32例。所有患者手术术前未进行放化疗治疗。

1.2主要试剂和仪器 逆转录反应试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、DNA提取试剂盒Trizol(Ambion公司)，RNAlater solution(Invitrogen公司)，琼脂糖(Ambion公司)，氯仿异丙醇(上海生工)，DNA甲基化转化试剂盒(天根生化科技有限公司)，实时荧光定量仪(美国ABI公司)。

1.3实验方法 提取总RNA：将组织标本采用RNAlater solution保存于冰箱中，提取RNA时取出冰箱中标本，室温下解冻，采用异硫氰酸胍-苯酚法提取RNA：称取组织0.05～0.10 g加入Trizol研磨为颗粒状，室温下使核酸蛋白复合物分离，加入氯仿震荡，离心，取上层水相至新管中，加入异丙醇，离心，得到RNA沉淀，室温下干燥RNA沉淀。RNA质量检测：采用分光光度仪测定OD260值和OD280值，计算RNA浓度，RNA浓度=40×稀释倍数×OD260，计算OD260值/OD280值，OD260值/OD280值在1.8～2.0为纯度满意；用RNA电泳检测RNA完整性。

1.4不同组织标本中HOTAIR基因及其调控基因HOXD10表达量的测定 设计PCR引物，将乳腺癌组织癌旁组织总RNA逆转录为cDNA，反应条件为42℃1 h，95℃ 5 min。在PCR的基础上加入荧光染料进行实时荧光定量测定乳腺癌组织、癌旁组织、前哨淋巴结组织及腋窝淋巴结组织中HOTAIR基因及其调控基因HOXD10的表达量。

1.5乳腺癌组织及癌旁组织中HOTAIR基因的甲基化测定 提取乳腺癌组织和癌旁组织基因组DNA，用亚硫酸盐处理DNA，设计相应的非甲基化和甲基化引物序列，进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴别DNA序列的甲基化情况。

1.6观察指标 ①比较乳腺癌、癌旁组织中HOTAIR、HOXD10相对表达量、HOTAIR非甲基化情况；②分析乳腺癌组织中HOTAIR基因与Ki-67和雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)相关性；③比较前哨淋巴结中腋窝淋巴结组织中HOTAIR相对表达量；④分析前哨淋巴结组织中HOTA1R与Ki-67及淋巴结转移的相关性。

1.7统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t及χ2检验，相关性分析采用Spearman相关分析。

2 结 果

2.1提取RNA的质量判断 乳腺癌组织中OD260/OD280比值为(1.87±0.08)，RNA浓度为(1.67±0.06)μg/μl；癌旁组织中OD260/OD280比值为(2.08±0.11)，RNA浓度为(2.11±0.13)μg/μl。OD260/OD280比值在1.8～2.0范围内为满意纯度，故乳腺癌组织和癌旁组织提取的RNA均为满意纯度。RNA电泳结果显示有18 S和28 S两条清晰的条带，肉眼见28 S条带亮度是18 S条带的1～2倍(见图1)，表示RNA没有降解。

1～6：为6个样本图1 部分样本RNA电泳图

2.2乳腺癌及癌旁组织中HOTAIR基因和HOXD10基因的表达情况 乳腺癌组织中HOTAIR相对表达量(10.22±3.65)显著高于癌旁组织(5.43±2.19，t=8.364，P=0.000)，乳腺癌组织中HOXD10相对表达量(10.79±2.13)与癌旁组织比较差异无统计学意义(10.16±2.35，t=0.845，P=0.362)。

2.3乳腺癌及癌旁组织中HOTAIR基因甲基化比较 乳腺癌组织和癌旁组织中HOTAIR基因均有非甲基化出现，乳腺癌组织中HOTAIR基因非甲基化率〔88.9%(40/45)〕显著高于癌旁组织〔44.4%(20/45),χ2=20.000,P=0.000〕。

2.4乳腺癌组织中HOTAIR基因与免疫组化指标的关系 HOTAIR基因与Ki-67和PR呈正相关(r=0.810，P=0.000；r=0.623,P=0.018)，与ER无显著相关性(r=0.514,P=0.087)。

2.5前哨淋巴结、腋窝淋巴结组织中HOTAIR的表达情况 前哨淋巴结组织中HOTAIR相对表达量显著高于腋窝淋巴结组织(9.27±1.19 vs 6.86±1.24,t=3.397,P=0.006)。

2.6前哨淋巴结组织中HOTAIR与Ki-67和淋巴结转移的关系 前哨淋巴结组织中HOTAIR与Ki-67和淋巴结转移率呈正相关(r=0.803，P=0.000；r=0.687，P=0.017)，与淋巴结转移数目无显著相关性(r=0.384，P=0.121)。

3 讨 论

HOTAIR为长链非编码RNA，长度2.2 kb，不编码蛋白质，和多硫蛋白抑制性复合物2关系比较密切，多硫蛋白抑制性复合物2介导发育中控制分化的大量基因的转录表达，HOTAIR可以连接不同的组蛋白修饰复合物，能够和H3K27及多硫蛋白抑制性复合物2连接，其与染色体的作用和基因沉默及多硫蛋白抑制性复合物2重定位相关，HOTAIR和多种恶性肿瘤的发生关系密切〔6，7〕。HOXD10基因能够抑制新生血管的生成，能够借助上皮细胞维持其分化表型，HOXD10基因可能为细胞侵袭的抑制基因，在乳腺癌的发生发展中抑制乳腺癌细胞的侵袭和移行。HOTAIR基因和乳腺癌的关系被不少研究证实，在乳腺癌组织和转移性乳腺癌中表达量均升高，和乳腺癌的死亡率关系密切等〔8～10〕。张开炯等〔11〕研究发现乳腺癌患者血浆和乳腺癌组织中HOTAIR基因呈高表达，血浆中HOTAIR水平和淋巴结转移和雌激素受体显著相关，血浆中HOTAIR诊断乳腺癌的曲线下面积为0.82，灵敏度为73.3%，特异度为93.3%，认为血浆中HOTAIR的高表达可以作为乳腺癌诊断的标志物；杨韬等〔12〕干涉HOTAIR基因的表达能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖，促进其凋亡。本研究结果发现乳腺癌组织中HOTAIR表达量升高与上述研究结果一致，提示HOTAIR和乳腺癌的发生发展及乳腺癌的侵袭转移关系密切。本文结果还发现乳腺癌组织中HOTAIR的调控基因HOXD10没有明显变化，可能为HOTAIR在乳腺癌中通过建立其他新的调控关系发挥作用，也可能和本实验样本量少，存在实验误差有关。

DNA甲基化在基因表观调控修饰中发挥重要作用，诱发肿瘤发生的重要机制之一为基因调控区域CpG岛的异常去甲基化和甲基化，人类基因的非甲基化和甲基化水平处于平衡状态下，如果非甲基化和甲基化失去平衡，则可能会发生肿瘤或者其他疾病〔13〕，长链非编码RNA在基因调控修饰方面也发挥重要作用，在对基因的调控修饰中两者可能协同发挥作用，也可能单独发挥作用。本研究结果发现乳腺癌组织中HOTAIR基因非甲基化率显著高于癌旁组织。DNA的低甲基化能够促进细胞的克隆，形成肿瘤的细胞一般为低甲基化的细胞，本研究结果表明HOTAIR基因在乳腺癌发生发展中的作用可能和HOTAIR基因的低甲基化有关。

孕激素和乳腺细胞增生关系密切，孕激素水平升高能够使乳腺组织对孕激素的感受性增强，促进乳腺增生甚至发生乳腺癌；Ki-67能够反映肿瘤增殖活性，是和细胞增殖关系密切的核抗原，乳腺癌组织中Ki-67阳性表达的细胞增殖活跃、恶性程度高、侵袭性强、肿瘤生长快、转移率高，预后比较差〔14，15〕。乳腺癌的发生发展和Ki-67及雌激素受体关系密切。本结果表明HOTAIR基因、Ki-67、孕激素受体在乳腺癌的发生发展及乳腺癌的侵袭转移中可能存在一些共同作用机制。