京尼平苷对INS-1细胞增殖与凋亡的影响
2018-12-13,,,,,,,
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2型糖尿病是以慢性高血糖为主要特征的一种代谢性疾病,病理特征为胰岛素调控葡萄糖代谢能力的下降及胰岛β细胞功能缺陷所导致的胰岛素分泌减少[1]。越来越多的动物实验和临床研究证实2型糖尿病存在胰腺β细胞数量减少[2]。尸检结果表明,糖尿病病人较正常人,胰腺β细胞凋亡增加进而体积减小[3]。因此,促进β细胞增殖且抑制其凋亡是2型糖尿病治疗的重要方面。
京尼平苷(geniposide,GP)是中药栀子的有效成分,是一种新的胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体激动剂[4]。研究认为GLP-1受体激动剂能促进胰岛β细胞的增殖并抑制其凋亡[5- 6]。本实验用内质网应激诱导剂毒胡萝卜素[7](thapsigargin,Thap)处理大鼠胰岛β细胞系(INS-1),观察京尼平苷对INS-1细胞增殖及凋亡的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 大鼠INS-1购自国家实验细胞资源共享服务平台(北京总部);京尼平苷购自日本Wako公司;GLP-1购自英国TOCRIS公司;毒胡萝卜素购自Sigma公司;CCK-8、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自日本东仁公司;胎牛血清购自BI公司;磷酸缓冲盐溶液(PBS)、胰蛋白酶、RPMI 1640培养基购自生工生物公司;细胞培养瓶、培养板购自美国Corning公司。
1.2 仪器 电子天平购自赛多利斯科学仪器有限公司;倒置显微镜购自奥林巴斯公司;二氧化碳(CO2)细胞培养箱购自上海力申科学仪器有限公司;流式细胞仪购自美国BD公司;酶标仪购自美国BIoTek公司;超净工作台购自上海智城分析仪器有限公司。
1.3 INS-1细胞的培养 INS-1细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素、50 μmol/L β-巯基乙醇的RPMI 1640培养液,置5% CO237 ℃的细胞培养箱中培养。当细胞融合至70%~80%,用0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.4 CCK-8法测定细胞增殖 将INS-1细胞按1×104密度接种至96孔板,过夜后,用对照组、京尼平苷组、GLP-1组方法处理细胞24 h,弃培养液,按10∶1比例将培养液与CCK-8混匀,加入96孔板,孵育2 h,用酶标仪在450 nm下测吸光度(OD值)。
1.5 流式细胞仪测定细胞凋亡 INS-1细胞以1×106接种于6孔板,过夜后,按对照组、毒胡萝卜素组、毒胡萝卜素+京尼平苷组、毒胡萝卜素+GLP-1组处理细胞6 h。弃培养液,PBS洗1次,加0.25%的胰酶消化5 min,培养液终止消化。将细胞悬液收集到离心管中,1 000 r/min离心3 min。弃上清,加入预冷的PBS重悬,用300目滤网过滤,再次离心,弃上清,加入1×Annexin V binding buffer调整细胞量,加入Annexin V-FITC、PI Solution各5 μL,混匀,室温避光15 min,流式细胞仪检测。
1.6 CCK-8法测定细胞活力 将INS-1细胞按1×104密度接种至96孔板,过夜后,按对照组、毒胡萝卜素组、毒胡萝卜素+京尼平苷组、毒胡萝卜素+GLP-1组方法处理细胞6 h。弃培养液,加入 CCK-8与培养液的混合液,孵育2 h,用酶标仪在450 nm下测吸光度(OD值),并计算细胞存活率:存活率(%)=(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)×100%。
2 结 果
2.1 京尼平苷对INS-1细胞增殖的影响 用不同浓度的京尼平苷(1 μmol/L~100 μmol/L)和GLP-1(10 nmol/L)干预大鼠INS-1 24 h,发现京尼平苷同GLP-1一样,均能促进INS-1细胞的增殖,并有浓度依赖性。详见图1。
与Control比较,*P<0.01
图1京尼平苷对INS-1细胞增殖的影响
2.2 京尼平苷对Thap致INS-1细胞凋亡的保护作用 用毒胡萝卜素(1 μmol/L)处理INS-1细胞6 h,发现毒胡萝卜素组细胞早期凋亡率增加,毒胡萝卜素+京尼平苷(1 μmol/L~100 μmol/L)组或GLP-1(10 nmol/L)组早期凋亡率减少,提示京尼平苷或GLP-1均能减轻毒胡萝卜素导致的细胞凋亡,且京尼平苷的抗凋亡作用具有浓度依赖性。详见图 2、图3。
图2 各组细胞凋亡流式图
与control比较,*P<0.01;与Thap比较,#P<0.01
图3各组细胞凋亡率
2.3 京尼平苷对 Thap致INS-1细胞毒性的影响 用毒胡萝卜素(1 μmol/L)处理INS-1细胞6 h,同时用京尼平苷(10 μmol/L)及GLP-1(10 nmol/L)干预,可见毒胡萝卜素组细胞活力下降,数量减少,而京尼平苷及GLP-1可减弱毒胡萝卜素对细胞的毒性作用。详见图 4。
与Control比较,*P<0.01;与Thap比较,#P<0.01
图4京尼平苷对Thap致INS-1细胞毒性的影响
3 讨 论
糖尿病是一种慢性终身性疾病,需要长期药物治疗。随着糖尿病病程的延长,疾病的进展,胰岛素治疗成为很多病人不可避免的治疗方式。胰岛素降糖效果明确,但注射疼痛、低血糖频发、体重增加等副作用,以及由此带来的严重心理负担时刻困扰着病人。GLP-1受体激动剂的出现在一定程度上解决了上述难题。GLP-1受体激动剂是葡萄糖浓度依赖性的胰岛素促泌剂,具有注射次数少、低血糖发生概率小、可降低体重等优点,逐渐成为糖尿病治疗的新方向。中药栀子的主要活性成分京尼平苷是一种新型的GLP-1受体激动剂。多项研究均证实,京尼平苷具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌作用[4,8],且无须注射,可经胃肠道给药[9-10],因此关于京尼平苷的研究越来越受到科研人员的重视。
人体血糖的平稳与胰岛β细胞的数量密切相关[11]。β细胞的增殖、再生与死亡、清除一起维持着体内胰岛β细胞数量的动态平衡。因此,促进胰岛β细胞增殖,抑制其凋亡是糖尿病治疗的重要途径。研究表明,GLP-1受体激动剂能促进胰岛β细胞增殖并抑制其凋亡。本实验用京尼平苷干预大鼠INS-1,并用GLP-1作为阳性对照,观察京尼平苷对INS-1细胞增殖和凋亡的作用。实验结果表明,京尼平苷可浓度依赖性地促进INS-1细胞的增殖,但促增殖能力低于GLP-1。毒胡萝卜素是内质网Ca2+-ATP酶选择性抑制剂,可以不可逆地使内质网钙池排空,使胞质内Ca2+浓度持续升高,诱导细胞发生内质网应激反应并最终发生凋亡[12]。本实验用毒胡萝卜素处理INS-1细胞,诱导细胞凋亡,同时用京尼平苷或GLP-1共孵育,结果发现,毒胡萝卜素处理后,INS-1细胞发生了明显的凋亡,早期凋亡率达到(15.72±0.57)%。而用京尼平苷干预后,细胞早期凋亡率明显下降,最低达(5.11±0.25)%,并呈浓度依赖性,且抑制凋亡的作用强于阳性药物GLP-1[早期凋亡率(9.23±0.35)%]。同时,用CCK-8法测定了毒胡萝卜素处理后的细胞活力,发现京尼平苷同GLP-1一样,能减轻毒胡萝卜素对INS-1细胞的毒性作用,增加细胞活力。上述实验结果表明,京尼平苷能够促进INS-1细胞增殖并抑制其凋亡,同既往文献报道[9,13]是一致的,说明京尼平苷可通过促进胰岛β细胞数量的增加,抑制β细胞数量减少,从而维持体内一定的胰岛素分泌量来保持血糖稳定,起到降糖的作用。