hTERT启动子介导的PRPS2基因表达下调对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

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胶质瘤起源于神经胶质细胞，约占颅内中枢神经系统原发恶性肿瘤的50%～60%，是最常见的颅内原发肿瘤[1]。神经胶质瘤传统的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗。然而，胶质瘤的浸润性生长、对放化疗的耐受性使得胶质瘤的整体治疗效果欠佳[2]。磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)基因是编码体内嘌呤、嘧啶两种核苷酸从头合成、补救合成的关键酶基因。通过下调PRPS2基因表达，进而抑制胶质瘤细胞的增殖，有望成为胶质瘤基因治疗的新思路[3]。人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子具有高肿瘤靶向性及较强的启动活性，从而成为肿瘤靶向基因治疗中具有巨大潜力的启动子[4]。本研究拟通过hTERT启动子介导，利用RNAi技术下调神经胶质瘤U251细胞中PRPS2基因表达，研究其增殖、凋亡等生物学特性的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人胶质瘤U251细胞由本室保存；pGGN-hTERT-PRPS2干扰载体购自上海吉玛基因化学技术有限公司；胎牛血清购自四季青公司；DMEM购自GIBCO公司；质粒小提试剂盒购自Promega公司；Effectene Transfection Reagent购自QIAGEN公司；Cell Counting Kit8细胞增殖(CCK-8)试剂盒、Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物公司；Hoechst 33342购自碧云天生物技术研究所。

1.2 RT-PCR检测 采用RT-PCR方法检测干扰载体对U251细胞中PRPS2的mRNA水平的影响。取RNA 2 μg，5×PrimeScript Buffer 4 μL，加RNase Free dH2O至总体积20 μL，37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s，反转录得cDNA。PCR 扩增人PRPS2基因，上游引物为：5′- GATTGCGTCATCATCCAG AGT-3′；下游引物为：5′- CATTCGCCTTCTTCCTCTCT T-3′。引物由上海生工公司合成。反应条件为：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30 个循环。

1.3 细胞培养 人类胶质瘤细胞系U251细胞由实验室保存，含10%胎牛血清的Gibco高糖培养液，在37 ℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。用0.25%的胰酶消化，每2 d换液传代。取对数生长期细胞进行实验。

1.4 转染 参考说明书进行细胞转染。设空白对照组(无干预)、阴性对照组(转染pGGN-hTERT-PRPS2-C载体)和实验组(转染pGGN-hTERT-PRPS2-si载体)。

1.5 CCK-8检测细胞增殖能力 采用CCK-8实验检测PRPS2表达改变对细胞增殖能力的影响。将 96孔板每孔接种100 μL，约2 000个细胞。转染72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育1 h，用酶标仪检测A450。

1.6 Hoechst 33342染色检测细胞凋亡与坏死 采用Hoechst 33342染色检测细胞凋亡与坏死情况。在6孔板中，每孔接种1×106个细胞。转染72 h后，每孔加入5 μL Hoechst 33342染色液，混匀，4 ℃染色20 min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗1次，荧光显微镜观察。

1.7 Annexin V/PI检测细胞凋亡与坏死 采用Annexin V/PI检测细胞凋亡与坏死情况。用不含EDTA的胰酶消化收集细胞；用PBS洗涤细胞2次(1 000 r/min离心5 min)收集1×105～5×105细胞；加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-EGFP混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应15 min；流式细胞仪检测。

1.8 细胞周期分布检测 通过流式细胞仪采用PI染色检测细胞周期的变化。首先，用胰酶消化收集细胞；用PBS洗涤细胞2次，常温2 000 r/min离心5 min后收集1×106细胞；弃去上清，加入1.5 mL PBS，拍打成细胞悬液，加预冷的70%乙醇；4 ℃固定过夜；1 500 r/min离心5 min，弃去上清，PBS冲洗后加入100 μL RNase A，37 ℃水浴保温30 min，再加入400 μL PI染色液混匀，4 ℃避光30 min，使用流式细胞仪进行检测。

2 结 果

2.1 干扰载体对U251细胞PRPS2表达的影响 分别将PRPS2干扰载体转染U251细胞72 h后，收集并分别提取总RNA和总蛋白。RT-PCR检测细胞内PRPS2 mRNA的表达，结果显示，阴性对照组细胞中PRPS2相对表达量与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，而实验组细胞中PRPS2的相对表达量较阴性对照组明显下降(0.39±0.05与0.99±0.09，t=-13.21，P<0.05)。详见图1。

A为空白对照组；B为阴性对照组；C为实验组。与阴性对照组比较，*P<0.05

2.2 PRPS2表达下调对U251细胞增殖能力的影响 采用CCK-8检测细胞增殖能力。结果显示，阴性对照组细胞活性与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。而转染48 h后，实验组与阴性对照组相比，U251细胞活性明显降低(P<0.01)。实验组在转染48 h后细胞活性降低15.5%，转染72 h后降低16.1%，说明PRPS2表达下调对U251细胞的增殖产生抑制作用。详见表1。

表1 PRPS2表达下调对U251细胞增殖能力的影响(±s)

2.3 PRPS2表达下调对U251细胞凋亡的影响 Hoechst33342细胞染色结果显示，空白对照组、阴性对照组细胞核呈均匀淡色，而实验组细胞核出现典型的凋亡形态学改变，细胞核染色质高度聚集，可见亮蓝色小点，有的甚至亮到发白，有的出现核碎裂，产生凋亡小体。详见图2。进一步采用Annexin V/PI双染色法对细胞凋亡情况进行定量。结果显示，阴性对照组细胞凋亡率与空白对照组相比，差异无统计学意义[(18.41±1.60)% 与(17.93±1.79)%，t=0.44，P>0.05]；实验组细胞凋亡率为(27.16±1.57)%，与阴性对照组相比差异有统计学意义(t=8.70，P<0.05)，说明下调PRPS2基因的表达可显著增加U251细胞的凋亡。详见图3。

A为空白对照组；B为阴性对照组；C为实验组

A为空白对照组；B为阴性对照组；C为实验组。与阴性对照组比较，*P<0.05

2.4 PRPS2表达下调对U251细胞周期的影响 分别将PRPS2干扰载体转染U251细胞72 h后进行PI染色后，通过流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果显示，阴性对照组与空白对照组比较，各个阶段细胞数量差异均无统计学意义(P>0.05)，PRPS2基因表达下调后，U251细胞的周期发生明显变化，G1期细胞数量显著增加(P<0.05)，S期细胞数量显著减少(P<0.05)，G2/M期差异无统计学意义。说明PRPS2基因低表达能够导致U251细胞阻滞于G0/G1期，细胞分裂减缓。详见表2、图4。

表2 PI染色检测下调PRPS2表达对U251细胞周期的影响(±s) %

A为空白对照组；B为阴性对照组；C为实验组

图4 PI染色检测PRPS2表达下调对U251细胞周期的影响

3 讨 论

神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，具有高发病率、复发率、死亡率和低治愈率的特点。因为传统手术、放化疗等治疗手段的局限性，所以从分子机制角度研究胶质瘤的发生、发展，为临床提供新的治疗策略就显得尤为重要。文志华等[5]研究发现花生四烯酸乙醇胺可通过神经酰胺从头合成通路，与神经酰胺呈浓度依赖性协同作用，从而抑制人胶质瘤U251细胞的增殖并诱导其早期凋亡。薛欢鸽等[6]通过siRNA靶向沉默ABCE1基因，可显著降低U251细胞的增殖和迁移能力。朱虹帆等[7]发现人胶质瘤组织细胞较正常脑组织CEP55表达明显增高，抑制CEP55的表达可抑制人胶质瘤251细胞的增殖，同时促进人胶质瘤细胞的凋亡。陈照亮等[8]利用miR-592通过直接靶向Runx2来诱导神经胶质瘤细胞凋亡，进而抑制细胞的生长。

PRPS2编码的PRPP是体内嘌呤、嘧啶从头合成和补救合成的重要底物，同时也是该通路上的重要调节因子，在细胞增殖中发挥重要作用[9]。阻断肿瘤细胞核苷酸的合成也是目前临床广泛应用的抗代谢类肿瘤化疗药物的作用机制。阻断PRPS2的表达可有效阻断增殖较快的组织中核苷酸从头合成途径，进而阻断肿瘤细胞的增殖。陈颖等[10]下调宫颈癌hela细胞中PRPS2基因的表达后，发现hela细胞活性及增殖能力降低、细胞迁移能力下降。Xue等[11]研究神经母细胞瘤发病机制中关键驱动基因MYCN，发现PRPS2与SDC1共同受到MYCN和TFAP4调控后参与神经病母细胞瘤的增殖及转移。肿瘤细胞的新陈代谢与正常细胞不同，Burkhart等[12]对肿瘤细胞在肿瘤微环境发生改变时代谢相关分子机制进行了研究，发现HUR在胰腺癌细胞对抗缺糖损伤时的应激性新陈代谢中发挥着关键作用，而PRPS2是HUR调控的关键靶点之一，与HUR的表达呈正相关。

hTERT启动子在正常细胞中无活性，而在肿瘤细胞中有显著活性。利用hTERT启动子构建肿瘤细胞特异性表达载体，并将其利用在肿瘤基因靶向治疗中，有良好的肿瘤特异性和安全性，对肿瘤细胞的凋亡和肿瘤的抑制有良好的效果[13]。诸多研究利用hTERT启动子介导不同目的基因的表达，研究其对肿瘤的作用。Jacob等[14]通过构建hTERT启动子介导调控TNF相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)基因表达载体，仅在卵巢癌细胞中发挥作用，而不会对正常细胞产生影响，特异性干扰促进卵巢癌细胞发生凋亡。Li等[15]构建了hTERT启动子介导调控TRAIL基因的腺病毒载体和巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子介导调控TRAIL基因的腺病毒载体，并在体内、体外进行实验，发现hTERT启动子的启动能力略微低于巨细胞病毒启动子，但是其对正常细胞无影响，而促进了人胶质瘤细胞的凋亡。Kalinichenko等[16]将hTERT启动至与antioxidant response element (ARE) 相结合，增强了NRF-2转录因子肿瘤细胞中的转录活性，进一步提升了5-氟尿嘧啶对肺癌细胞的杀伤特异性。

上述研究与本研究有良好的一致性，证明利用hTERT启动子构建肿瘤细胞特异性表达载体在肿瘤基因靶向治疗中有良好的应用前景，该方法有望成为肿瘤治疗的新靶点。本研究利用RNAi技术，通过hTERT启动子介导PRPS2表达下调，与对照组相比，细胞活力明显降低，细胞凋亡明显增高。由此可见，PRPS2在胶质瘤U251细胞的增殖中发挥着重要的促进作用。在细胞周期的检测中，PRPS2表达下调后，U251细胞发生G0/G1期阻滞。

利用hTERT启动子构建PRPS2下调载体在胶质瘤基因靶向治疗中，有良好的应用前景，该方法有望为胶质瘤治疗提供新的思路。