蒙古族、汉族人群多发性硬化病人人类白细胞抗原DQB1、DPB1等位基因多态性的对比研究

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多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统白质脱髓鞘为特点的自身免疫性疾病，多发于青壮年，急性或亚急性起病，可出现感觉异常、视觉障碍、运动障碍、疲劳、疼痛和认知障碍等多种临床表现[1-2]。由遗传和环境等多种因素引起，其中人类白细胞抗原(HLA)多态性是一个最重要的遗传因素。HLA基因位于6号染色体短臂上6p21.3区，由一系列紧密连锁的基因座组成，在抗原呈递、免疫应答中起着重要的作用。目前研究较多的是DQB1、DPB1、DRB1等Ⅱ类基因，主要集中于HLA第二外显子，具有高度的多态性，与多发性硬化疾病的易感性密切相关[3-4]。本研究通过高分辨分型的方法检测HLA-DQB1、HLA-DPB1等位基因多态性在内蒙古自治区蒙古族、汉族人群多发性硬化病人中的分布情况，探讨蒙古族、汉族人群MS病人HLA-DQB1、DPB1等位基因多态性的特点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年3月—2017年3月在我院及合作医院就诊的蒙古族MS病人26例、汉族MS病人43例，分别纳入蒙古族MS组、汉族MS组。蒙古族MS组，男10例，女16例；年龄28岁～45岁(35.4岁±6.3岁)；病程1年～12年(4.3年±1.2年)。汉族MS组，男14例，女29例；年龄26岁～49岁(35.9岁±6.9岁)；病程2年～11年(4.6年±1.5年)。另选43名健康体检者为对照组，其中男17名，女26名，年龄25岁～46岁(36.2岁±6.5岁)。蒙古族MS组、汉族MS组病人年龄、性别比例等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有病人均符合2010年的MacDonald临床诊断标准，排除其他与组织相容性抗原有关的疾病。

1.2 方法 基因组DNA的提取：采用苯酚-氯仿抽提外周血中的基因组DNA，步骤如下：①采集病人外周血，加入5倍体积的三蒸水裂解8 min，离心，弃去上清；②加入DNA细胞裂解液；③加入蛋白酶K，65 ℃水浴30 min；④加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液，剧烈震荡，离心，将上清移至新的离心管中；⑤添加预冷的无水乙醇，离心，弃上清；⑥用预冷的75%乙醇洗涤沉淀，干燥，用三蒸水溶解。

等位基因HLA-DQB1、HLA-DPB1测序：参照AlleleSEQR DQB1定型试剂盒(美国Atria Genetics公司)采用SBT法对HLA-DQB1、HLA-DPB1进行高分辨率分型，步骤如下：①聚合酶链式反应(PCR)，8 μL HLA-DQB1/HLA-DPB1引物混合物，2μL基因组DNA，0.1 μL Amplitaq Gold酶。HLA-DQB1基因扩增条件为预变性95 ℃，10 min；95 ℃，20 s；60 ℃，30 s；72 ℃，2 min，36个循环；HLA-DPB1基因扩增条件为预变性95 ℃，10 min；95 ℃，20 s；59 ℃，30 s；72 ℃，2 min，36个循环。②PCR产物纯化，将PCR产物用ddH2O稀释3倍后，加入3 μL ExoSAP-IT，37 ℃孵育15 min后，80 ℃孵育15 min。③反应结束后，自动测序仪(ABI3100)测序。

基因分型：根据测序所得核苷酸序列，与HLA数据库最新公布的HLA-DQB1、HLA-DPB1等位基因序列进行比对。

1.3 统计学处理 使用SPSS 17.0进行统计分析。直接计数法计算基因频率(%)，组间比较采用χ2检验，当理论数<5时采用Fisher精确概率法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DQB1等位基因频率 检测到13个DQB1等位基因片段，汉族MS组HLA-DQB1*0302基因频率明显低于对照组(P<0.05)，HLA-DQB1*0602基因频率明显高于对照组(P<0.05)，但蒙古族MS组、汉族MS组HLA-DQB1*0302、HLA-DQB1*0602基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 3组DQB1等位基因频率比较 例(%)

2.2 DPB1等位基因频率 检测到12个DPB1等位基因片段，蒙古族MS组、汉族MS组HLA-DPB1*0501基因频率明显高于对照组(P<0.05)，蒙古族MS组、汉族MS组HLA-DPB1*0501基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 3组DPB1等位基因频率比较 例(%)

3 讨 论

目前MS发病机制尚不明确，与遗传、环境、免疫等多种因素有关，以急性、亚急性起病为主，急性发作期外周血中辅助性T细胞和抑制性T细胞出现异常，说明MS疾病与免疫因素有关[5]。在所有的遗传因素中，HLA与MS关联最为密切。HLA是一个复杂的遗传多态性系统，包括Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类区域，Ⅰ类、Ⅱ类区域是具有高度多态性的区域，可产生不同的基因型组合或单倍型。Ⅰ类区域包括A、B、C等HLA位点，Ⅱ类区域主要包括DP、DQ、DR等亚区。HLA-Ⅰ类基因编码的蛋白主要作用是向CD8+T淋巴细胞呈递抗原，制约特异性T淋巴细胞的效应功能。HLA-Ⅱ类基因编码的蛋白主要作用是向CD4+T淋巴细胞呈递抗原，制约辅助性T淋巴细胞的识别功能。

研究发现，我国南方汉族人群MS与HLA-DQB1*0502相关，与HLA-DQB1的0601和0602无关[6]，且MS易感基因可能存在性别差异，可能与男性激素的保护作用有关。Field等[7]发现与MS疾病独立相关的HLA-DRB1*1501、HLA-DRB1*0301等7个SNPs，HLA-DPB1位于常见的Ⅱ类基因HLA-DRB1、DQA1和DQB1的着丝粒上，在重组时与DQA1和DQB1等基因分离，并且不受DRB1、DQA1和DQB1基因调节的影响。HLA等位基因频率在不同地域和种族中的分布具有很大的差异，可能与遗传背景、地理环境有关。本研究发现了13个DQB1和12个DPB1等位基因片段，其中起主要作用的是HLA-DPB1*0501、HLA-DQB1*0602、HLA-DQB1*0302三个等位基因位点。Fernández等[8]发现，等位基因DQB1*0602与MS病人明显相关，这与本研究结果相似，说明HLA-DQB1*0602可能是MS病人的易患基因。本研究还发现蒙古族、汉族MS病人HLA-DQB1*0302基因频率明显低于对照组，说明HLA-DQB1*0302可能是MS的抵抗基因。日本MS病人与DPB1*0301关系密切[9]，此外还发现携带DPB1*0501基因的人群对自身免疫性疾病的易感性高，包括早发的甲状腺炎、系统性红斑狼疮、1型糖尿病等。本研究共发现了12个DPB1等位基因片段，蒙古族、汉族MS病人HLA-DPB1*0501等位基因频率明显高于对照组，说明HLA-DPB1*0501可能是MS的易患基因。吴晓牧等[10]发现南方汉人 MS 可能与HLA-DPB1*2101有关，与HLA-DPB1*0501无关，与本研究结果不同。

本研究通过高分辨分型的方法探讨了内蒙古地区蒙古族、汉族MS病人与HLA-DQB1、DPB1等位基因多态性的关系，蒙古族、汉族人群多发性硬化可能与人类白细胞抗原HLA-DQB1*0302、HLA-DQB1*0602和HLA-DPB1*0501有关。本研究发现蒙古族、汉族MS病人的DQB1、DPB1多态性差异无统计学意义，推测起主要作用的是遗传因素，地理环境可能有一定影响。