实时荧光PCR探针法和DNA测序法应用于CYP2C9和VKORC1基因检测的对比研究

黄振勇 龙东娣 毛振敏 肖诚胤 陈素敏 陈清群 蔡凯 李介华

【摘要】 目的：比較实时荧光PCR探针法和DNA测序法检测细胞色素氧化酶P450（CYP2C9）和维生素K环氧化物还原酶复合体1（VKORC1）基因多态性的一致性，建立适用于临床推广的华法林基因多态性检测的方法。方法：本研究随机收集清远市人民医院20例就诊患者的全血标本，应用实时荧光PCR探针法和DNA测序法检测其CYP2C9和VKORC1基因的多态性，结果运用Excel软件统计并进行比较分析。结果：两种方法对CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测结果一致，且实时荧光PCR探针法比DNA测序法更简易、经济、快捷。结论：与DNA测序法相比，应用实时荧光PCR探针法检测CYP2C9和VKORC1基因的突变具有较高的临床应用价值，比较适用于临床检测。

【关键词】 实时荧光PCR探针法； DNA测序法； CYP2C9； VKORC1

【Abstract】 Objective：To compare the polymorphism of cytochrome oxidase P450（CYP2C9） and vitamin K epoxide reductase complex 1（VKORC1） gene by real-time fluorescent PCR and DNA sequencing.Methods of clinical promotion of warfarin gene polymorphism.Method：The whole blood samples of 20 patients in Qingyuan Peoples Hospital were randomly collected.The polymorphisms of CYP2C9 and VKORC1 genes were detected by real-time fluorescent PCR and DNA sequencing.The results were analyzed by Excel software and compared.

Result：The results of two methods were consistent with the detection of CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphism，and the real-time fluorescent PCR method was simpler，more economical and faster than DNA sequencing method.Conclusion：Compared with DNA sequencing method，real-time fluorescent PCR probe method detection of CYP2C9 and VKORC1 gene mutations has a high clinical value，is more suitable for clinical testing.

【Key words】 Real-time fluorescent PCR probe method； DNA sequencing method； CYP2C9； VKORC1

First-authors address：The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Qingyuan 511518，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.034

华法林（warfarin）作为一种香豆素衍生物，是目前世界上应用最多的维生素K拮抗剂，临床上作为重要的口服抗凝药已经广泛应用于动静脉血栓性疾病、房颤等急需抗凝的疾病[1]，但其治疗窗较窄（剂量不足有血栓风险，过量服用可出现致命性出血）、个体间剂量差异较大（达到适宜抗凝效果的个体间剂量差异可达10～20倍）严重困扰临床用药[2]。研究显示，CYP2C9和VKORC1基因多态性对华法林用量和效果有显著影响，而不同个体间存在明显的基因差异；美国食品药品监督管理局（FDA）于2010年修订华法林的药物处方信息时，添加了利用基因型检测进行个体化用药的具体说明，要求临床医生根据用药者的基因型按FDA提供的剂量推荐表进行规范用药。

现时对CYP2C9、VKORC1检测的方法主要为测序法，也见有微阵列芯片法、高分辨率熔解曲线法与基于连接酶反应的 PCR法的报道[3-6]。但这些方法进行 PCR 反应后都要进行后续步骤的检测，具有成本较高，仪器要求严格，步骤复杂、易产生污染的缺点。本研究拟利用PCR探针法，根据已知CYP2C9和VKORC1基因序列，设计其多态性位点的特异性荧光探针引物，行单管多重PCR扩增，直接根据实时荧光数据进行不同基因型的判读，并利用Sanger测序法验证PCR结果的可靠性与稳定性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取2017年12月送检至清远市人民医院分子诊断中心检测的20例抗凝全血标本。

1.2 主要试剂与仪器 全血人基因组核酸提取纯化采用Lab-Aid 824核酸提取仪及其配套的Lab-Aid 824核酸提取Mini试剂盒，两者均由厦门致善生物科技股份有限公司提供；NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计由美国Thermo公司提供；CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒由武汉友芝友医疗科技股份有限公司提供；CFX-96荧光定量PCR仪由美国Bio-Rad公司提供。

1.3 样本核酸提取

1.3.1 在提取试剂条椭圆形孔中加入混匀的全血标本200 μL和1 mol/L的DTT溶液30 μL。

1.3.2 將已加样的试剂条放置于试管架上放入核酸提取仪中，选取自动提取程序进行核酸提取。

1.3.3 运行完毕后，用移液器吸取出核酸溶液合约350 μL，用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计进行DNA浓度及纯度分析，确保DNA含量>10 ng/μL，OD260/280在1.8～2.0。所提取的DNA当日使用，使用完毕后分装一管100 μL外送测序，剩余的DNA保存于-80 ℃备查。

1.4 实时荧光PCR检测

1.4.1 配置反应体系 管1和管2分别加入CYP2C9*3和VKORC1反应液各23 μL。

1.4.2 将待测样本DNA、弱阳性对照、空白对照2 μL分别加入已分装的2种反应管中，盖上管盖，编号后转移至PCR仪上检测。

1.4.3 PCR扩增检测 按37 ℃ 10 min UNG处理，95 ℃ 5 min预变性，然后按95 ℃ 15 s→62 ℃ 60 s40循环进行扩增；荧光通道设置为FAM、VIC，荧光信号收集设置在62 ℃ 60 s结束时。

1.4.4 按照表1进行PCR检测结果判断，确定样本基因多态性。

1.5 DNA测序分析 将所提取的DNA样本100 μL送由广东凯普生物科技股份有限公司进行Sanger法DNA测序。

1.6 统计学处理 运用Excel软件统计并进行两种方法检测结果的一致性比较分析。

2 结果

2.1 实时荧光PCR探针法和DNA测序法 本实验20例标本中，两种方法对CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测结果一致，均显示：CYP2C9基因14例纯合野生，6例杂合突变，未发现纯合突变；VKORC1基因1例纯合野生，9例杂合突变，10例纯合突变，见表2。

2.2 两种方法比较 通过对比两种检测方法，实时荧光PCR法相对于DNA测序法而言更为简单，结果判读更为直观简便，部分结果见图1～4。

3 讨论

华法林是目前应用最广泛的口服抗凝药物，其导致的并发症发生率也相应较高。这是由于华法林治疗窗较窄、个体间剂量差异较大（达到适宜抗凝效果的个体间剂量差异可达10～20倍），临床医生按传统经验用药容易在取得疗效的同时也可能给部分患者带来困扰（剂量不足有血栓风险，过量服用可出现致命性出血）[7]。

细胞色素P450酶2C9（CYP2C9）是华法林的主要代谢酶之一[7]。其编码基因位于染色体10q2412，全长55 kb，含有9个外显子和8个内含子[8]。CYP2C9基因具有高度的遗传多态性，常见的基因变异体是CYP2C93*2和CYP2C93*3，基因编码的酶的活性分别比野生型CYP2C93*1降低了30%和80%，导致了CYP2C9基因变异个体对华法林的需求降低，并且携带这两个等位基因的个体服用华法林达到稳态血药浓度的时间较长，且早期出血的风险增高[9]。CYP2C9的抗凝作用主要通过维生素K环氧化物还原酶复合体1基因（VKORC1）酶介导，是华法林作用的靶点。VKORC1基因的单核苷酸多态性直接影响着华法林的敏感性和抵抗性，主要研究位点有1173C>T（rs9934438），3730G>A（rs7294），1639A>G（rs9923231）[10]。

因为CYP2C9、VKORC1是影响华法林剂量及代谢的主要基因，在应用华法林前，对CYP2C9、VKORC1基因进行相应检测，将对临床上安全、及时、有效地使用华法林起到重要的指导作用。鉴于CYP2C9和VKORC1基因对华法林个体用药的差异性，美国食品药品监督管理局（FDA）于2007年8月，将CYP2C9和VKORC1两种基因型的检测纳入了华法林药品说明书中的警示信息中。并于2010年修订华法林的药物处方信息时，添加了利用基因型检测进行个体化用药的具体说明，根据基因型提供一个剂量推荐表[11]。

目前对CYP2C9、VKORC1进行检测的方法主要为测序法，利用实时荧光PCR进行检测的报道有高分辨率熔解曲线法与基于连接酶反应的PCR法[12]。这些方法进行PCR反应后均要进行后续步骤的检测，其中测序法成本较高，高分辨率熔解曲线法仪器要求较高，基于连接酶反应的PCR法步骤复杂、易产生污染[14-16]。

本研究比较分析了实时荧光PCR探针法和DNA测序法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性结果的一致性，实验表明两种方法的检测结果是一致的。CYP2C9检测中，检测出14例纯合野生，

6例杂合突变，未发现有纯合突变。张惠文、陈盛强曾经统计过CYP2C9健康汉族人CYP2C9基因分布情况，突变主要发生杂合突变，其中突变型纯合子的频率仅为0.145 5[17-20]。因此本次研究没有检测到CYP2C9纯合突变，可能是由于样本量不足。

DNA测序法检测虽然具有较高的准确度，被视为金标准，但由于其耗时长，操作繁琐复杂，而且需要特殊且昂贵的仪器设备，目前大多数医院临床实验室均无法满足[21-22]。而实时荧光PCR探针法全程仅用约3 h便能检测完成，并且由于结果判读直观简便，仅需要实时荧光PCR仪，且能和DNA测序法检测的结果一致。

由此可见，与DNA测序法相比，实时荧光PCR探针法具有快速、简便、结果判读直观等特点，更适合广泛应用于临床检测CYP2C9和VKORC1基因多态性。

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