水酶法提取南瓜籽油过程中乳状液酶法联合化学法破乳工艺研究

张根生 杨慧铎 岳晓霞 刘志鑫许春明

ZHANG Gen-sheng YANG Hui-duo YUE Xiao-xia LIU Zhi-xin XU Chun-ming

(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076)

(College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin, Heilongjiang 150076, China)

随着科技的发展，很多非传统的植物油提取工艺受到关注[1]。水酶法作为一种新型提油方法，被广泛地应用在大豆、花生、油菜籽、松籽和玉米胚芽等多种油料作物的油提取上[2-4]。在使用水酶法提取南瓜籽油时，反应温度低，保持油的品质同时又提高了蛋白质利用率[5]。但是油提取率较低，只有小部分的油以游离油的形式存在，大部分的油是乳化状态，存在于离心后的乳状膏或乳状液中。为了提高游离油提取率，乳状液破乳至关重要。乳状液是由蛋白质、磷脂和碳水化合物等组成的稳定状态[6]。两亲性水溶性蛋白吸附在O/W型乳状液界面上，形成一层具有立体屏障的硬质膜，阻止油的释放。Bos等[7]研究表明磷脂具有很高的表面活性，对乳状液稳定性影响显著。而碳水化合物通过增加黏度或使水相凝胶[8-9]，来减少油体的聚集影响游离油的释放，且效果随其浓度的增加而增加[10]。

水酶法提取植物油中乳状液的破乳方法有：物理破乳方法[11-13]、化学破乳方法[14]、生物酶法破乳及多种方法联合使用[15-16]。其中生物酶法破乳通过水解乳状液中的蛋白质或表面磷脂来释放油脂，实现破乳。朱敏敏等[17]对水酶法提取番茄籽油过程中乳状液破乳进行了研究，使用风味蛋白酶破乳，出油率提高至51.57%。Wu等[18]采用蛋白酶对水酶法提取的大豆油乳状液进行破乳，游离油得率为88%。Chabrand等[19]在大豆乳状液中添加溶血磷脂酶A1破乳，游离油提取率为95%。目前，对于水酶法提大豆油乳状液酶法破乳研究较多，而对南瓜籽油破乳研究较少。王丽波等[20]进行水酶法提取南瓜籽油研究，南瓜籽出油率为38.34%，提取率为85%左右，虽然提取率较高，但是在最后提取南瓜籽油时，直接在离心液中加入正已烷进行萃取，使用有机试剂破乳，违背了水酶法提油绿色安全的初衷。本研究拟采用酶法对水酶法提南瓜籽油的乳状液进行破乳，同时对破乳后pH对乳状液稳定性的影响进行分析，从而通过生物酶法联合化学法提高破乳率，并且比较破乳前后油体平均粒径大小分布，为提高水酶法提南瓜籽油的提取率提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

南瓜籽：黑龙江赛美食品有限公司；

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(酶活力2.0×105U/g)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(酶活力6.0×104U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力5.0×105U/g)：北京奥博星生物技术有限责任公司；

磷脂酶(1.0×105U/g)：湖南世纪华星生物工程有限公司；

硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、无水乙醇、氨水、石油醚、氢氧化钠、盐酸：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司。

1.1.2 主要仪器

电热鼓风干燥箱：DHG-9420A型，上海一恒科学仪器有限公司；

中草药粉碎机：FW135型，天津市泰斯特仪器有限公司；

恒温水浴锅：DK-98-1型，天津市泰斯特仪器有限公司；

集热式恒温磁力搅拌器：CL-200型，巩义市予华仪器有限责任公司；

酸度计：PB-10型，赛多利斯科学仪器有限公司；

凯氏定氮仪：KDY-9820型，苏州江东精密科学仪器有限公司；

旋转蒸发器：R205型，上海申胜生物技术有限公司；

台式高速离心机：TG16-WS型，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；

Zetasizer Nano粒度分析仪：ZEN3500型，英国马尔文仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳状膏主要成分测定

(1) 水分含量的测定：按GB 5009.3—2016的直接干燥法执行。

(2) 油脂含量的测定：按GB 5009.9—2016的碱水解法执行。

(3) 蛋白质含量的测定：按GB 5009.5—2016的凯氏定氮法执行。

(4) 总灰分含量的测定：按GB 5009.4—2016执行。

(5) 磷脂含量测定：按GB/T 5537—2008执行。

1.2.2 乳状膏制备工艺流程

南瓜籽仁→烘烤(105 ℃、1 h)→粉碎、过40目筛→浸泡1 h→磨浆→木瓜蛋白酶酶解(酶添加量4 500 U/g、酶解pH 7.5、酶解温度50 ℃、酶解时间3 h)→灭酶(80 ℃、10 min)→离心分离(3 600×g、20 min)→乳状液→静置12 h→取上层乳状膏

1.2.3 酶法破乳工艺流程

乳状膏加去离子水→搅拌→酶解→灭酶(80 ℃、10 min)→离心分离(3 600×g离心20 min)→游离油

1.2.4 酶的种类对破乳率的影响 取一定质量的乳状膏加入去离子水使液料比为1∶1 (mL/g)，搅拌成均一的乳状液后分别调节pH和温度为各酶最适，依次添加2 000 U/g的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、黄曲霉酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、磷脂酶进行酶解，酶解时间为2 h，灭酶，冷却至室温后离心，抽取游离油称量并计算破乳率。通过比较分析这5种酶对破乳率的影响。

1.2.5 酶法破乳工艺单因素试验

(1) 液料比对破乳率的影响：取一定质量的乳状膏，分别以0.5∶1.0，1.0∶1.0，1.5∶1.0，2.0∶1.0，2.5∶1.0 (mL/g)的液料比添加去离子水，搅拌成均一的乳状液后调节pH为10.5，添加地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶2 000 U/g，50 ℃ 酶解2.0 h，灭酶，冷却至室温后离心，抽取游离油称量并计算破乳率。

(2) 酶添加量对破乳率的影响：取一定质量的乳状膏加入去离子水使液料比为1∶1 (mL/g)，搅拌成均一的乳状液后调节pH为10.5，分别添加地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的量为1 000，2 000，3 000，4 000，5 000 U/g，50 ℃酶解2.0 h，灭酶，冷却至室温后离心，抽取游离油称量并计算破乳率。

(3) 酶解温度对破乳率的影响：取一定质量的乳状膏加入去离子水使液料比为1∶1 (mL/g)，搅拌成均一的乳状液后调节pH为10.5，添加地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶2 000 U/g，分别在40，45，50，55，60 ℃酶解2.0 h，灭酶，冷却至室温后离心，抽取游离油称量并计算破乳率。

(4) 酶解pH对破乳率的影响：取一定质量的乳状膏加入去离子水使液料比为1∶1 (mL/g)，搅拌成均一的乳状液后分别调节pH至9.5，10.0，10.5，11.0，11.5，添加地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶2 000 U/g，50 ℃酶解2.0 h，灭酶，冷却至室温后离心，抽取游离油称量并计算破乳率。

(5) 酶解时间对破乳率的影响：取一定质量的乳状膏加入去离子水使液料比为1∶1 (mL/g)，搅拌成均一的乳状液后调节pH为10.5，添加地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶2 000 U/g，50 ℃酶解时间分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，灭酶，冷却至室温后离心，抽取游离油称量并计算破乳率。

1.2.6 破乳率的测定

(1)

式中：

R——乳状液的破乳率，%；

M1——破乳所得游离油质量，g；

M2——乳状液中含油质量，g。

1.2.7 响应面优化试验 以酶法破乳单因素试验结果为基础，依据Box-Behnken的原理设计四因素三水平的优化试验，选液料比、酶添加量、酶解温度、酶解pH 4个因素为自变量，每个因素做3个水平。以破乳率为响应值，采用Design-Expert 8.0 作图，通过响应面分析法优化酶法破乳工艺条件。

1.2.8 南瓜籽油滴粒径分布和Zeta电位测定 在离心分离前，分别取一定质量未破乳和经优化的酶法破乳的乳状液，加去离子水配置成0.1 g/L的溶液，分别取1 mL放入可抛弃型聚苯乙烯样品池。设置折射率(RI)1.47，吸收值0.001，使用粒度分析测定油滴粒径。在离心分离前，取等质量经酶法破乳的乳状液，分别调节不同pH(3，4，4.5，5，6，7，8，9)后配置成0.1 g/L的溶液，取样注入弯曲式毛细管样品池中，进行Zeta电位测定。

2 结果分析

2.1 乳状膏主要成分

乳状膏主要成分测定结果见表1。由表1可知，乳状膏中的水分、脂肪、蛋白质含量较高。

2.2 酶种类的选择

由图1可知，在各酶最适条件和相同添加量的情况下进行酶解反应，地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶破乳率最高，破乳所得游离油最多，而磷脂酶破乳率低于大多数蛋白酶。因为木瓜蛋白酶酶解所制得的南瓜籽乳状膏中的蛋白质被地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶水解形成小分子肽或氨基酸，使得由蛋白质形成的膜所包围的油脂释放出来，得到游离油，实现破乳。虽然水解磷脂也是影响乳状液稳定性重要因素之一[19]，但是由表1可知，南瓜籽乳状膏中磷脂含量偏低而蛋白质含量较高，所以对于南瓜籽乳状膏来说，蛋白酶更适合破乳，最后选择地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶为反应酶。

不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.3 酶法破乳工艺单因素试验

2.3.1 液料比对破乳率的影响 由图2可知，液料比对破乳率影响显著，随着水相的增加破乳率也明显升高，当液料比为1∶1 (mL/g)时破乳率达到最高值为83%；继续增大水相，破乳率逐渐下降。这是由于在乳状液中添加少量的水，可以降低乳状液的黏度同时增加液体的流动性[21]，增大酶与底物的接触面积，使得酶解更加充分。但是过量添加水相会导致底物质量浓度变小，酶浓度变低就不能充分地与底物反应，破乳率会因此下降。

不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.3.2 酶添加量对破乳率的影响 由图3可知，破乳率随着酶添加量增加而逐渐变大，当酶添加量为3 000 U/g时，破乳率达到最高值(85.18%)；继续增加酶添加量时，破乳率缓慢下降并趋于平稳。说明当酶添加量逐渐增加至3 000 U/g 时，乳状液中酶浓度增大，可以渗透到脂质体膜内，大部分的蛋白质被水解，脂多糖被分解，由大量蛋白质构成的膜结构被破坏，更多游离油被释放出来，破乳率变大；而再继续添加更多酶只会影响游离油的释放，因为未反应的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶附着在油体上或者其周围，使得游离油不能被提取完全[22]。

不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.3.3 酶解温度对破乳率的影响 由图4可知，在地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的适宜反应温度范围内进行单因素试验，当温度在40～50 ℃时，破乳率随着温度的升高而迅速增大直至最高点，破乳率为最大值(85.08%)；当酶解温度继续升高时，破乳率缓慢下降直至平稳。因为当温度逐渐升高至50 ℃，温度接近酶的最适反应温度，可更好地作用于底物；而当温度升至60 ℃时，小部分酶因为温度上升而活力下降，导致破乳率小幅度下降。

2.3.4 酶解pH对破乳率的影响 由图5可见，随着酶解pH的增加，pH在9.5～10.5时，破乳率也明显增大。当pH增加至10.5～11.5时，破乳率下降。这可能是当pH调节至11.5时，乳状液中负电荷增多，蛋白质和油滴形成了极稳定状态，对游离油的释放造成阻碍。

不同字母表示差异显著(P<0.05)

不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.3.5 酶解时间对破乳率的影响 由图6可知，随着酶解时间的延长，破乳率缓慢上升了5.7%，当酶解时间超过2.5 h时，破乳率迅速下降了12.7%。这可能是随着时间的延长，酶与底物发生反应，大量小油体聚集成大油滴，更多的游离油逐渐被释放出来，破乳率升高；而当时间超过2.5 h，酶解时间过长，由于蛋白质乳化特性，部分大油滴变成乳化油，无法以游离油的形式释放出来，导致破乳率大幅度下降[22]。

2.4 响应面优化酶法破乳工艺条件

2.4.1 响应面试验设计及结果 根据酶法破乳的单因素试验结果，设计四因素三水平设计见表2。以破乳率为响应值，进行响应面分析，其试验设计及结果见分别表2、3。

不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.4.2 响应面结果分析 通过Design-Expert 8.0统计分析软件对破乳率的数据结果进行分析，建立破乳率对反应温度、液料比、酶添加量、pH的二次回归模型如下：

R=88.42+0.13A-0.55B+0.23C-0.39D-0.37AB+0.34AC-0.46AD-0.64BC+1.48BD+0.12CD-0.88A2-3.03B2-2.28C2-2.59D2。

(2)

表2 响应面试验因素水平表

表3 响应面试验方案及结果

利用Design-Expert 8.0对二次回归方程模型进行分析，破乳率的方差分析结果及其显著性结果见表4。

由表4可知，模型的P<0.000 1，说明二次响应面回归模型极显著；失拟项P=0.265 4>0.05，这表示失拟项差异不显著；决定系数R2=94.14%，说明模型能够解释94.14%的响应值变化。根据以上各值可以判断出，该模型与试验拟合度较高，试验误差小，可信度较高，可以很好地描述试验结果，可实现酶法破乳工艺条件的优化。由各因素的F值可以得到4个因素对破乳率影响大小顺序为：B(液料比)>D(pH)>C(酶添加量)>A(酶解温度)。

2.4.3 交互作用分析 由表4及图7可知，BD的P<0.000 1，B和D交互作用对破乳率影响极显著，破乳率随着B与D水平的增加而升高；BC的P<0.05，说明B和C交互作用对破乳率影响显著，破乳率随着液料比和酶添加量交互作用的增加先增加后下降；随着A和D交互水平增加，破乳率变化比较平缓，与前2个交互作用相比较，此交互作用对破乳率影响不显著。

2.4.4 酶法破乳最佳工艺条件验证实验 通过响应面法优化出最佳酶法破乳工艺为：液料比0.9∶1.0 (mL/g)、酶添加量3 078 U/g、酶解pH 10.4、温度51 ℃。由响应面法得出此条件下酶法破乳的破乳率理论值为88.50%。为了验证该试验的准确性和可靠性，将最佳工艺条件进行验证实验，每组重复3次取平均值。最后测得破乳率为88.39%，与响应面预测所得的理论值相比，相对误差为0.12%，此结果表明经响应面优化后的条件可以更好地预测酶法破乳工艺。

2.5 破乳前后油滴粒径分布及pH对乳状液稳定性的影响

2.5.1 破乳前后的油滴粒径分布 由图8可知，酶法破乳前油滴的平均粒径为2.950 μm，破乳后平均粒径增加至48.000 μm，粒径明显增大。这是因为破乳前油体被蛋白质所形成的膜包裹着，以较小的油滴形式不均匀地分布在乳状液中，经过酶法破乳后，蛋白质膜被水解破坏，油体被释放出来聚集成更大的油滴。比较破乳前后油滴平均粒径大小，更加直观地表达了破乳的重要性。

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型119.1414.008.5133.13<0.000 1**A0.191.000.190.740.404 2B3.641.003.6414.170.002 1**C0.651.000.652.530.134 3D1.851.001.857.200.017 8*AB0.531.000.532.070.171 8AC0.461.000.461.800.201 0AD0.861.000.863.330.089 4BC1.661.001.666.480.023 3*BD8.731.008.7333.99<0.000 1**CD0.061.000.060.230.636 3A24.991.004.9919.440.000 6**B259.651.0059.65232.23<0.000 1**C233.651.0033.65130.99<0.000 1**D243.511.0043.51169.40<0.000 1**残差3.6014.000.26失拟项2.9910.000.301.990.265 4净误差0.604.000.15总和122.7328.00

图8 粒径分布

2.5.2 不同pH下乳状液的Zeta电位 由图9可知，Zeta电位值随着pH增加而降低。当pH在 4.25～4.50时，pH接近南瓜籽蛋白的等电点，Zeta电位值接近于0，此时蛋白质溶解性最差乳化力最小，吸附在油滴和水之间的蛋白最少，由于不存在静电排斥作用，油滴易聚集在一起，乳状液处于极不稳定的状态[23]；当pH在8～9时，Zeta电位值<-37.3 mV，乳状液负电荷增多，蛋白质带相同电荷相斥，由蛋白质膜所包裹的油滴不易上浮聚集在一起，乳状液处于稳定状态[24]。这也证明为了酶法破乳后酸化处理的意义，酶法处理后乳状液pH值在8～9时，乳状液处于稳定状态，为了再次提高破乳率，调节pH为4.25～4.50时接近南瓜籽蛋白等电点，使乳状液处于极不稳定状态，游离油释放的更充分。为方便工业化生产，调节pH至4.5，使破乳率提高至95.47%。

图9 pH对乳状液Zeta电位的影响

3 结论

本试验选用地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶，酶解由水酶法提取南瓜籽油过程中产生的乳状液，实现破乳提高南瓜籽油的提取率。通过单因素试验和响应曲面优化试验，得出酶法破乳的最佳工艺为液料比0.9∶1.0 (mL/g)、添加地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶3 078 U/g、调节pH 10.4、酶解温度51 ℃、酶解时间2.5 h，验证所得破乳率为88.39%。同时还研究了pH对乳状液稳定性的影响，发现在酶法破乳后进行酸化处理，通过调节pH至4.5，破乳率可达到95.47%。通过比较破乳前后油体粒径分布的变化趋势，更加确定了本试验所研究的破乳方法的优势，为水酶法提取南瓜籽油的破乳工艺条件提供了可靠的理论依据。但本试验只适用于水酶法提取南瓜籽油的破乳研究，有局限性，还需更深入地研究各种油料作物水酶法提取的破乳工艺。