响应面法优化山葵酸菜加工工艺的研究

李杰，罗倩，张琴萍，邬晓勇，孙雁霞

（成都大学药学与生物工程学院，四川成都610106）

山葵（Wasabi）一种绿色高山植物，植株高约为20公分～50公分，具有一种特殊的辛辣味及香气。一般生长在原始森林里，被誉为“绿色黄金”、“东方山葵”。在原野山谷流水等相对阴湿环境中栽培出的山葵品质最好，是加工各类山葵产品的适宜原料。山葵的各种保健作用也在近年来越来越受到人们的重视[1]。人体各组织器官的损伤主要来源于氧化，Shin S和Korenori Y的研究都表明了山葵的抗氧化作用[2-3]；山葵风味物质的刺激作用，也可促进脂肪的消耗，从而达到减肥和预防肥胖症的作用[4-5]；Aoyagi S[6]研究发现山葵中的黑芥子硫甘酸钾具有一定的抗癌作用。一直都有对于山葵产品的研发，昝加志等[7]研发出一款新型的山葵抑菌口香糖，山葵特殊的辛辣味可以用于制作一款特殊风味的山葵调味酱[8]。响应面法也早用于山葵以及山葵产品加工工艺的研究，刘艳全等[9]使用响应面法对山葵异硫氰酸酯制备工艺进行优化，林艳如等[10]使用响应面法对山葵叶柄调味菜防腐工艺进行优化。

酸菜是我国传统的发酵蔬菜制品，有着近千年的历史[11]。但普通酸菜因为使用盐渍方式进行发酵，因此大部分酸菜中含有一定量的亚硝酸盐，长期食用含亚硝酸盐的食品会导致消化系统癌症[12]。因此寻找一种更为经济安全的腌制工艺，必将促进酸菜行业的发展。采用面汤水[13]发酵工艺加工山葵酸菜，可以有效的增加山葵中异硫氰酸酯的稳定性，同时降低酸菜中亚硝酸盐含量。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺盐酸盐、亚硝酸钠、氢氧化钠、酚酞（均为国产分析纯）：天津市光复科技发展有限公司。

UV5100B型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；JA3103N型电子天平：上海明桥精密科学仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司。

1.2 山葵酸菜中亚硝酸盐含量测定

按照GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中分光光度法测定山葵酸菜的亚硝酸盐含量。

1.3 山葵酸菜加工工艺流程

参考民间酸菜加工工艺[14]和刘夏薇以及谢玉鹏对新产品酸菜工艺研究[15-16]并结合山葵中特殊风味物质异硫氰酸酯的特性，确定山葵酸菜工艺流程如下：

山葵花苔→原料选取→切制→清洗→漂烫→面汤水发酵→包装→巴氏灭菌→冷却→包装→检验→成品

1.4 山葵酸菜的感官评价标准

在经过多次试验后，制得感官、性状等存在明显差异的产品，为了能较公正有效地判断制得的山葵酸菜品质的好坏，在山葵酸菜自身特性的基础上，结合赵国忠、赵丹对酸菜品质研究中酸菜感官评价标准[17-18]，最终从色泽（20分）、滋味（35分）、组织状态（30分）和气味（15分）4个方面，分别设立评分标准，来有效地对山葵酸菜产品感官品质进行综合评比，感官质量评分标准见表1。

表1 山葵酸菜感官评定指标和评分参考Table 1 The sensory evaluation index and grading reference of Wasabi sauerkraut

感官评定方法：取适量样品放入洁净的瓷盘中，在充足的自然光下观察其色泽、组织形态、检查有无外来杂质，并嗅其气味、尝其滋味。由10人组成感官评定小组，分别山葵酸菜的色泽（20分）、滋味（35分）、组织状态（30分）和气味（15分）进行评分，取其平均值作为山葵酸菜感官评定的最后得分。

1.5 山葵酸菜中总酸（以乳酸计）含量的测定

按照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》中的酸碱中和滴定法进行测定。

1.6 单因素试验设计

经过多次预试验确定，分别考察发酵面汤水比例（4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%）、腌制时间（12、16、20、24、28、32、36 h）、腌制温度（10、15、20、25、30、35、40℃）对山葵酸菜感官品质和总酸含量的影响。

1.7 响应面试验

在单因素试验的基础上，利用响应面分析软件Design Expert 8.06中的Box-Behnken程序，设计腌制面汤水比例、腌制温度、腌制时间三因素三水平的试验，最终通过响应面试验结果确定山葵酸菜的最佳腌制发酵条件。

2 结果分析

2.1 亚硝酸盐标准曲线

按照GB 5009.33-2016中分光光度法得到亚硝酸盐标准曲线如图1。

得到的亚硝酸盐标准曲线方程为y=0.027 7x-0.000 2，R2=0.999 9，拟合度较高。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 腌制面汤水的比例对山葵酸菜感官品质和总酸含量的影响

对不同比例面汤水发酵腌制的山葵酸菜进行感官评价和总酸含量测定，结果见图2、图3。

图2 不同面汤水比例腌制山葵酸菜感官评分Fig.2 The sensory score of Wasabi sauerkraut with different proportion of noodle soup

图3 不同面汤水比例腌制山葵酸菜中总酸含量Fig.3 The total acid content of Wasabi sauerkraut with different proportion of noodle soup

由图2可知选用面粉含量为7%的面汤水对山葵叶柄和花苔进行腌制，制得的山葵酸菜达到感官评分最高，在面汤水过低或者过高都会逐渐降低山葵酸菜的感官品质。从图2可以得出，对山葵酸菜滋味影响因素最显著的为面汤水比例，在山葵酸菜的腌制过程中，如果面汤水比例过低，将使得山葵花苔得不到充分的腌制发酵，从而影响山葵酸菜的滋味；当面汤水比例过高不仅会降低山葵酸菜自身的滋味，同时由于面汤水比例过高，会使山葵酸菜的色泽降低，进而降低山葵酸菜的感官品质。由图3可知，选用面粉含量为7%的面汤水对山葵进行腌制，制得的山葵酸菜的总酸含量最高。因此在山葵酸菜腌制发酵工艺优化中选择面汤水比例7%作为响应面优化试验中心点。

2.2.2 腌制时间对山葵酸菜感官品质和总酸含量的影响

对不同腌制时间制得的山葵酸菜进行感官评价和总酸含量测定，结果见图4、图5。

图4 不同腌制时间腌制山葵酸菜感官评分Fig.4 The sensory score of Wasabi sauerkraut with different curing time

图5 不同腌制时间腌制山葵酸菜中总酸含量Fig.5 The total acid content of Wasabi sauerkraut with different curing time

由图4可知，腌制时间为24 h制得的山葵酸菜感官评分最高。从图4可以明显看出，在腌制时间逐渐增加的过程中，山葵酸菜的各项感官品质都在逐渐增加。但当腌制时间超过24 h后，山葵酸菜的各项感官品质就会降低，其中最明显的表现为组织形态的急剧变坏，原因可能为腌制时间过久，使得山葵的花苔和叶慢慢的开始变软，甚至腌制时间更久之后，山葵酸菜会出现软烂的现象。由图5可知，从腌制时间12 h到24 h，总酸含量上升趋势明显；当腌制时间超过24 h后，总酸含量上升趋势逐渐平缓。因此在山葵酸菜腌制发酵工艺优化中选择发酵时间24 h作为响应面优化试验中心点。

2.2.3 腌制温度对山葵酸菜感官品质和总酸含量的影响

对不同腌制温度制得的山葵酸菜进行感官评价和总酸含量测定，结果见图6、图7。

图6 不同腌制温度腌制山葵酸菜感官评分Fig.6 The sensory score of Wasabi sauerkraut with different curing temperature

图7 不同腌制温度腌制山葵酸菜中总酸含量Fig.7 The total acid content of Wasabi sauerkraut with different curing temperature

由图6可知将山葵酸菜置于25℃下进行发酵，制得的山葵酸菜感官评分最高。由图7可知，在腌制温度为25℃时，山葵酸菜中总酸含量达到最高。从图中还可发现温度超过25℃后总酸含量降低，造成这种现象的原因可能是高温抑制了乳酸菌的代谢活动，从而使总酸含量降低。因此山葵酸菜腌制发酵过程中选择腌制温度25℃作为响应面优化试验中心点。

2.3 响应面试验结果分析

2.3.1 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，利用响应面分析软件Design Expert 8.06中的Box-Behnken程序，设计腌制面汤水比例为6%、7%、8%，腌制温度为20、25、30℃，腌制时间为20、24、28 h三因素三水平的试验，最终通过响应面试验结果确定山葵酸菜的最佳腌制发酵条件。

本试验总共有17个试验点，12个分析试验点，5个中心试验点。因素水平见表2，得到的山葵感官评分和总酸含量结果见表3。

表2 Box-Behnken试验因素水平Table 2 Box-Behnken experimental factor level

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Box-Behnken experimental design arrangement and results

使用软件Design Expert 8.06对表3中的数据进行回归拟合分析，最终得到的回归模型方程为：

感官评分=98.047＋0.242A－1.057B－3.206C－1.109AB＋3.834AC＋0.221BC－10.495A2－7.225B2－7.880C2

总酸含量=1.856 4＋0.035 4A－0.071 4B＋0.105 3C＋0.038 3AB+0.053 5AC-0.068 5BC-0.343 1A2-0.329 6B2-0.002 3C2

2.3.2 模型方差分析

感官评分回归模型方差分析见表4，总酸含量回归模型方差分析见表5。

表4 感官评分回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the fifi tted quadratic polynomial model with the sensory score

表5 总酸含量回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fifi tted quadratic polynomial model with the total acid content

由表4和表5可知，两个模型具有极高的显著性（P＜0.001），变量对于响应值的影响都表现为显著或极显著。失拟项P＞0.05，表现为不显著，这表明设计模型具有良好的拟合性，因此可以使用此模型对于山葵酸菜腌制发酵过程中的工艺参数进行分析和预测。

2.3.3 响应面分析

将回归模型中的任意一因素固定在一个水平，就可以得到另外两个变量因素对山葵酸菜感官评分和总酸含量的交互影响结果。

2.3.3.1 感官品质响应面分析

腌制面汤水比例、腌制时间、腌制温度对山葵酸菜感官评分的交互影响如图8～图10。

图8 腌制面汤水比例和腌制温度对感官评分交互影响的响应面图和等高线图Fig.8 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing temperature with the sensory score

图9 腌制面汤水比例和腌制时间对感官评分交互影响的响应面图和等高线图Fig.9 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing time with the sensory score

图10 腌制温度和腌制时间对感官评分交互影响的响应面图和等高线图Fig.10 The response surface plot and contour plot of interaction between curing temperature and time with the sensory score

由图8中的等高线图呈现椭圆形可以看出腌制面汤水比例和腌制温度有一定的交互作用，但是交互作用并不显著，并且沿A轴等高线相对密集一些，这说明对山葵酸菜感官品质的影响腌制面汤水比例比腌制温度大一些。从三维立体图中可以看出，感官评分出现最大值出现在腌制面汤水比例和腌制时间都在中心部分的位置。由图9的三维立体图中可以看出，随着腌制面汤水比例的增加，感官评分呈现一个抛物线趋势；并且在腌制时间增加时，抛物线的顶点也呈现一个抛物线趋势，这说明山葵酸菜感官品质的极大值出现在腌制面汤水比例和腌制时间都处于中心点附近的位置。由图10中的等高线图中腌制温度和腌制时间等高线密集程度基本相同可以看出腌制温度和腌制时间的交互作用并不显著。

2.3.3.2 总酸含量响应面分析

腌制面汤水比例、腌制时间、腌制温度对山葵酸菜感官评分的交互影响结果如图11～图13所示。

图11 腌制面汤水比例和腌制温度对总酸含量交互影响的响应面图和等高线图Fig.11 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing temperature with the total acid content

图12 腌制面汤水比例和腌制时间对总酸含量交互影响的响应面图和等高线图Fig.12 The response surface plot and contour plot of interaction between proportion of noodle soup and curing time with the total acid content

图13 腌制时间和腌制温度对总酸含量交互影响的响应面图和等高线图Fig.13 The response surface plot and contour plot of interaction between curing temperature and time with the total acid content

由图11中的等高线图中腌制温度和腌制时间等高线密集程度基本相同可以看出腌制面汤水比例和腌制温度的交互作用并不显著，这一点从三维立体图中两者的变化曲面变化趋势相差不大也可以证明。由图12中的等高线图可以看出腌制面汤水比例和腌制时间的交互作用比较显著，并且沿A轴等高线更密集，这说明对山葵酸菜总酸含量的影响腌制面汤水比例比腌制时间更大。由图13三维立体图中可以看出，随着腌制温度增加，总酸含量趋势呈现抛物线趋势，这可能是在低温时，随着温度的增加，使山葵酸菜中的乳酸菌的代谢活动更加活跃从而使山葵酸菜中的总酸含量增加；在温度过高时，高温对乳酸菌的代谢作用抑制过强，从而降低了山葵酸菜中的总酸含量。

2.3.4 腌制发酵工艺的优化和可靠性验证

通过对响应面三维立体图和等高线图进行分析，可以基本确定腌制发酵工艺的最佳工艺参数的范围。并且通过软件优化功能以山葵酸菜感官评分为主要指标对工艺参数进行优化得到最佳工艺条件为：腌制面汤水比例为6.98%，发酵温度为24.62℃，腌制时间为23.76 h。此工艺条件下生产出来的山葵酸菜理论上感官评分能达到98.45分，总酸含量为1.836 g/100 g。考虑到实际生产中的便利，将得到的最佳工艺条件调整为：腌制面汤水比例为7%，发酵温度为25℃，腌制时间为24 h。以此工艺条件为山葵酸菜的腌制工艺，进行3次平行试验，最终得到的山葵酸菜感官评分为98分，总酸含量为1.869 g/100 g。从理论值与实际值对比可以发现两者非常接近，说明此模型能较好的模拟山葵酸菜腌制发酵工艺，并能预测出最终得到山葵酸菜的感官品质与总酸含量。

2.3.5 山葵酸菜中亚硝酸盐含量结果分析

利用优化后工艺所得的山葵酸菜，按照GB 5009.33-2016试样处理方法进行处理，得到山葵酸菜试样于波长538 nm处测吸光度（重复3次），并计算山葵酸菜中亚硝酸盐含量，结果表明未检出亚硝酸盐。

3 结论

本文以山葵酸菜的腌制发酵工艺为主要研究对象，以山葵叶柄和花苔为原料采用响应面法对山葵酸菜的加工工艺流程进行优化。最后通过响应面试验得到最佳腌制工艺为：腌制面汤水比例为6.98%，发酵温度为24.62℃，腌制时间为23.76 h。考虑到实际生产中的便利，将得到的最佳工艺条件调整为：腌制面汤水比例为7%，发酵温度为25℃，腌制时间为24 h。以此工艺条件得到的山葵酸菜感官评分为98分，总酸含量为1.869 g/100 g，产品中未检出亚硝酸盐。通过对山葵酸菜加工工艺的优化，用面汤水发酵工艺，有效的减少山葵酸菜中亚硝酸盐有害成分的含量，形成一款具有山葵特色风味的山葵酸菜，在极大的提高了山葵原材料利用率和山葵附加值的同时，也提升了山葵酸菜的品质和安全性。