平喘宁调节ERK信号通路干预哮喘气道重塑的机制

方向明，刘 静，严郑元, 王心恒，屈 彬

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

支气管哮喘是由多种炎性细胞浸润后分泌的炎性递质和细胞因子作用于气道的慢性炎症。丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是细胞内信号转导蛋白酶的重要蛋白，是连接细胞外与细胞核之间信号转导的重要通路，与细胞的增殖有着紧密联系。其中，细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)作为MAPKs家族中的一个亚族而存在，在细胞增殖、分化、凋亡等过程中起到重要调节作用。前期研究发现，平喘宁治疗哮喘的效果明显，然而平喘宁的效应与ERK信号通路的关系尚不明确，故设计此实验，旨在通过对ERK信号通路上作用因子进行研究，进一步揭示平喘宁治疗哮喘的作用机制。

1 材料

1.1 药物 平喘宁(组成：麻黄、杏仁、半夏、陈皮、黄芪、太子参、浙贝母各9 g，苏子、地龙、防风各6 g，细辛3 g)：饮片来源于安徽中医药大学国医堂，平喘宁高、中、低剂量组的生药含量分别为1.96、0.98、0.49 g/mL；地塞米松(批号 0300402)：上海信谊药业有限公司产品；桂龙咳喘宁胶囊(批号 Z20053135)：山西桂龙医药有限公司。

1.2 试剂与仪器 卵蛋白(批号 A8040)、SDS(批号 20130105487)：Sigma；Trizol(批号 NR0002)、RIPA细胞裂解液(批号 P0013B)：碧云天；甘氨酸[批号 GB/T14156-93(I1352)]：Solarbio；TEMED(批号 20130105458)、Tris碱(批号 3255794)、过硫酸铵(批号 10111994)、丙烯酰胺(批号 10023150)：广州伟伯科技有限公司；PVDF(批号 24937-79-9)：millipore；ECL超敏发光试剂盒(批号 W001A)：南京善本生物科技有限公司；预染蛋白Marker(批号 MK054)：合肥博美生物科技有限公司；p-ERK1抗体(编号 bs4621)、ERK1抗体(编号 bs1122)：Bioword；Actin(编号 131322)：北京中杉；山羊抗兔IgG(编号 107015)：上海合星生物科技有限公司。

2 方法

2.1 动物分组、模型复制及给药 选用SPF级6～8周龄雄性SD大鼠140只，体质量(250±20)g，购自安徽医科大学实验动物中心[动物生产许可证号为SCXK(皖)2011-003]。将其随机分为空白对照组，模型组，平喘宁高、中、低剂量组，桂龙咳喘宁组，地塞米松组。每组20只。

参照文献[1-2]方法复制大鼠寒哮模型。除正常对照组外，其余6组在第1、8天，均腹腔注射10%卵蛋白1 mL以致敏；第15天开始，超声雾化1%卵蛋白溶液，连续7 d，以诱发哮喘，每次时间为30 min；然后将大鼠放入0～2 ℃可调节的寒冷箱中，每日1次，每次2 h。以大鼠出现精神萎靡，活动度下降，反应不灵敏，身体震颤、蜷缩，毛色晦暗，饮食量下降，大便稀，频频点头，呼吸急促时伴有腹部收缩等现象，提示大鼠寒哮模型复制成功。正常对照组参照上述方法，在致敏及激发时采用9.0 g/L氯化钠注射液替换卵蛋白溶液进行注射。模型复制成功后，第21天开始给药，正常对照组、模型组以等容积9.0 g/L氯化钠注射液进行灌服；地塞米松组将地塞米松药片碾碎后采用9.0 g/L氯化钠注射液将其溶解，然后按照0.405 g/kg灌服；桂龙咳喘宁组按照10 g/kg灌服；平喘宁高、中、低剂量组分别按照19.6、9.8、4.9 g/kg灌服。灌胃4周，禁食24 h后，进行哮喘激发试验。在2 h内，用10%水合氯醛腹腔注射将大鼠麻醉，开胸，取肺组织，分离左右肺，取左肺，用中性甲醛固定；将右肺置于冻存管内，放在-80 ℃冰箱中冻存以备使用。

2.2 肺组织形态学观察 将左肺置于中性甲醛中固定，脱水，石蜡包埋，切成3 mm组织薄片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，光镜下观察肺组织的病理变化。

2.3 免疫组织化学法检测TIMP-1、MMP-9表达水平 先用二甲苯脱蜡，再用乙醇梯度脱水，然后进行抗原修复，阻断内源性过氧化物酶。模型组与各治疗组滴加一抗溶液(1∶150)，正常对照组滴加PBS；将切片置于湿盒中，于4 ℃冰箱中过夜。第2天于常温中复温0.5～1 h，用PBS冲洗2遍，滴加二抗，20 min后再用PBS冲洗2遍，甩干，DAB显色，封片，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，中性树胶封片。胞浆内棕黄色颗粒提示MMP-9、TIMP-1表达阳性。采用BI-2000医学图像分析系统，于400倍显微镜下观察切片，测其胞浆中积分光密度值，每张切片随机取5个视野，计算平均值。

2.4 Western blot法检测PDGF、p-ERK1、ERK1蛋白表达水平 剪取100 mg肺组织，加入1 mL RIPA细胞裂解液将组织进行裂解。置于离心机中，采用12 000 r/min离心10 min，收集上清液(含有组织总蛋白)。蛋白变性：蛋白样品与2倍SDS-PAGE蛋白上样缓冲液等量混匀，沸水浴10 min。然后进行电泳、转膜、封闭、抗体孵育、检测等过程，最后采用Image J软件分析灰度值。

3 结果

3.1 各组大鼠气管组织形态学变化 光镜下观察，正常对照组大鼠的支气管结构未见改变，气管上皮结构正常，未见明显炎性细胞浸润。模型组镜下观察到支气管黏膜出现充血水肿，黏膜皱襞增多，黏膜下以及气管周围出现大量炎性细胞，如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞浸润，气管上皮细胞出现脱落、剥离，支气管管壁增厚，管壁平滑肌肌层以及基底膜增厚，气管明显变窄。与模型组比较，各治疗组炎性细胞浸润减少，气管上皮细胞脱落减少，气管平滑肌增厚较治疗前有不同程度的降低，气管痉挛变窄状况改善。其中地塞米松组大鼠炎性细胞浸润减少，气管上皮脱落降低，气管平滑肌增厚情况改善；桂龙咳喘宁组大鼠在炎性细胞浸润、气管上皮脱落及气管平滑肌增厚等方面有不同程度改善，但效果不如地塞米松组明显；平喘宁高剂量组大鼠气管上皮完整，炎性细胞浸润程度与地塞米松组相近。见图1。

注:A.正常对照组;B.模型组;C.地塞米松组;D.桂龙咳喘宁组;E.平喘宁高剂量组;F.平喘宁中剂量组;G.平喘宁低剂量组图1 各组大鼠气管组织形态学变化(HE染色,10×20倍)

3.2 各组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1表达水平比较 与正常对照组比较，模型组MMP-9和TIMP-1表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组MMP-9和TIMP-1表达水平显著降低(P<0.05)；其中地塞米松组和平喘宁高剂量组MMP-9和TIMP-1表达水平低于其他3个治疗组。见表1和图2、图3。

3.3 各组大鼠肺组织PDGF、p-ERK1、ERK1蛋白表达水平比较 与正常对照组比较，模型组肺组织PDGF、p-ERK1和ERK1表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组肺组织PDGF、p-ERK1和ERK1表达水平显著降低(P<0.05)。见表2和图4。

表1 各组大鼠肺组织中MMP-9、TIMP-1相对表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注:A.正常对照组;B.模型组;C.地塞米松组;D.桂龙咳喘宁组;E.平喘宁高剂量组;F.平喘宁中剂量组;G.平喘宁低剂量组图2 各组大鼠肺组织中MMP-9表达水平比较(免疫组织化学法,10×40倍)

注:A.正常对照组;B.模型组;C.地塞米松组;D.桂龙咳喘宁组;E.平喘宁高剂量组;F.平喘宁中剂量组;G.平喘宁低剂量组图3 各组大鼠肺组织中TIMP-1表达水平比较(免疫组织化学法,10×40倍)

4 讨论

气道重塑是慢性哮喘反复发作的重要病理学改变。在促成纤维细胞增殖因子里，PDGF具有较强作用。并且PDGF又可通过活化的成纤维细胞的分泌，使静态的成纤维细胞大量活化，反过来产生叠加效应。而PDGF的活化信号是由Ras/raf/ERK级联通路转导的，Ras/raf/ERK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶众多途径的重要构成，而ERK1/2是该信号转导系统的重要通路之一[3]。

p-ERK1是由ERK1/2磷酸化产生的，细胞核内c-jun、NF-κB、c-fos等转录因子受到p-ERK1的影响，作用于磷酸化核转录因子和其他蛋白激酶等多种底物，对有关基因的转录产生作用，从而调节细胞的生长与发育等[4]。

在MMPs家族中，MMP-9和TIMP-1两者在哮喘气管壁细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积和重构中有着重要作用[5]。在正常生理情况下，MMP-9和TIMP-1维持在1∶1的相对稳定状态，使ECM降解和沉积达到平衡。哮喘发作时，肺组织中MMP-9病理性升高，上皮下成纤维细胞异常增殖、活化，致使胶原纤维大量出现，导致气道重构；TIMP-1也出现异常升高的情况，进一步加速ECM在气管内堆积，阻止组织恢复，促进上皮纤维化，加重气道重构的发生发展[6]。建立维持MMP-9和TIMP-1比例稳定的方法，可为哮喘提供新的治疗靶点[7]。

表2 各组大鼠肺组织PDGF、p-ERK1、ERK1相对表达水平比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：A.正常对照组；B.模型组；C.地塞米松组；D.桂龙咳喘宁组；E.平喘宁高剂量组；F.平喘宁中剂量组；G.平喘宁低剂量组

图4 Western blot法检测各组大鼠肺组织PDGF、p-ERK1、ERK1蛋白表达水平

平喘宁是临床用于治疗寒哮的经验方，由射干麻黄汤与三子养亲汤化裁而成，药物由麻黄、苏子、半夏、杏仁、地龙等中药组成，功效温肺化痰、止咳平喘，用于治疗寒哮证。本研究结果提示，平喘宁治疗寒哮的机制可能是通过调节ERK转导通路，降低PDGF、ERK1、p-ERK1的表达，调节MMP-9、TIMP-1的平衡，从而减轻气道炎症，抑制气道重塑。