基于网络药理学的益母草作用机制分析

2018-12-06李从林王博龙

中国中医药信息杂志 2018年12期

李从林王博龙

摘要：目的基于网络药理学方法研究益母草主要活性成分及药理机制，为新药研发提供参考。方法检索中药系统药理学分析平台（TCMSP）收录的益母草化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为标准筛选活性成分，并找出活性成分对应靶点。构建益母草活性成分-靶点网络、靶蛋白互作网络（PPI），运用DAVID平台进行靶点GO功能富集和KEGG信号通路富集。结果发掘益母草主要活性成分14种，对应靶点216个（包括5个关键靶点AKT1、TP53、IL-6、CALM2、JUN），参与生物过程509个。KEGG关键通路包括催产素信号通路、补体及凝血级联反应、血小板活化、TNF信号通路等。结论本研究初步揭示了益母草药效物质基础及多维药理作用，可为益母草开发利用提供参考。

关键词：益母草；网络药理学；蛋白互作；信号通路；靶点

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.024

中图分类号：R2-05；R285 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0102-05

Abstract： Objective To study the main active components and pharmacological mechanism of Leonuri Herba based on the network pharmacology； To provide references for research and development of new medicine. Methods Chemical components of Leonuri Herba from the TCMSP database platform were retrieved. The active components were screened by oral bioavailability （OB） ≥ 30% and drug-like （DL） ≥ 0.18， and the corresponding targets of active components were identified. Active components target network and target protein-protein interaction network were constructed， and DAVID platform was used for target GO function enrichment and KEGG signal pathway enrichment analysis. Results Totally 14 main active components and 216 corresponding targets were explored from Leonuri Herba， involving 5 key targets of AKT1， TP53， IL-6， CALM2 and JUN， and participated in 509 biological processes. The key pathways of KEGG included oxytocin signaling pathways， complement and clotting cascades， platelet activation and TNF signaling pathways. Conclusion The material basis and multi-dimensional pharmacological action of Leonuri Herba were preliminarily revealed， which provides basis for its development and utilization.

Keywords： Leonuri Herba； network pharmacology； protein-protein interaction； signal pathway； target

益母草为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的新鲜或干燥地上部分，具有活血调经、利尿消肿、清热解毒功效，常用于治疗月经不调、痛经闭经、恶露不尽、水肿尿少、疮疡肿毒[1]。现代研究发现其化学成分主要包括生物碱类、挥发油类、黄酮类、二萜类等[2]，具有降低血液黏度、保护心肌、抗氧化、抗炎等药理活性[3]。然而，其具體的活性物质基础及产生药理作用的分子机制尚不明确。

中药多成分、多靶点、低选择协同作用的特点是以线性研究为主的传统实验药理学面临的难题。王永炎院士提出中药的物质基础是复杂化学体系，而生物机体也是复杂生命系统，中药产品化学物质实体与机体生物活动的交互规律研究成为中药现代研究的重要切入点。相关研究必须采取整合策略，以多学科交叉、融合为基础，构建新的研究体系。

网络药理学融合了药学、生物学、计算机学及复杂网络分析等多学科的新技术与新成果，从化合物、靶点、信号通路等多角度入手，实现中药研究的综合网络分析，在预测和辨识中药活性成分群及作用靶点、阐明作用机制、解释组方规律、发现新适应症及新活性化合物等方面，具有独特优势和巨大潜力。该方法的整体性、系统性切合中药复杂体系的特点，已在脑心通胶囊、龙血竭肠溶片、冠心静胶囊等中药大品种二次开发的质量控制、作用机制、临床方面得到应用[4-6]。本研究采用网络药理学技术分析益母草药效物质基础及作用机制，为其开发利用提供参考。

1 资料与方法

1.1 活性成分及靶点筛选

检索中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：//lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“益母草”为关键词检索其活性成分及靶点。口服生物利用度（oral bioavailability，OB）反映化合物的吸收程度，类药性（drug-like，DL）为化合物与已知药物的相似性，二者在化合物成药性评价中起关键作用[7]，本研究以OB≥30%、DL≥0.18为标准筛选出候选成分，并挖掘文献报道补充一些重要化学成分。

1.2 活性成分-靶点网络构建

将得到的益母草活性成分所对应的靶点通过UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/uploadlists/）翻译成相应基因。再将化合物及相应基因导入Cytoscape3.4.0软件，绘制益母草活性成分-靶点网络图。度值反映网络中某节点与其他节点的连接数目，介数是网络中所有最短路径中经过该节点的路径的数目与最短路径总数的比，度值和介数是量化1个节点在网络中的重要性的重要拓扑参数。

1.3 靶蛋白互作網络构建

为明确益母草潜在靶蛋白之间的相互作用，将筛选得到的靶蛋白在STRING平台（https：//string-db. org/）构建蛋靶白互作（PPI）网络模型，将蛋白种类设置为“Homo sapiens（人类）”进行操作，最低相互作用阈值设为“medium confidence”（中等），其他参数保持默认设置。将PPI网络模型导入Cytoscape3.5.1软件，运用“Network Analysis”功能进行分析研究。依据度值、介数确定益母草关键靶蛋白。

1.4 KEGG信号通路与GO生物过程富集分析

将得到的潜在靶点在人类基因组注释数据库DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）进行KEGG信号通路富集分析和GO生物过程富集分析，以P<0.05进行靶基因筛选，分析益母草发挥药理作用的主要信号通路及生物过程。

2 结果

2.1 主要活性成分信息

筛选出益母草主要活性成分8种，由于益母草宁碱等6种成分具有明显药理活性[8-9]，故一并纳入活性成分研究，共得到14种主要活性成分，见表1。

2.2 主要活性成分-靶点网络

益母草主要活性成分网络拓扑学参数见表2，主要活性成分-靶点网络见图1。

2.3 靶蛋白互作网络

构建的PPI网络中包含212个节点（4个靶蛋白未参与PPI网络构建）、3387条相互作用连线。该网络平均度值为58.5，平均介数为0.036 2，根据网络拓扑学参数，共筛选出5个度值和介数均高于平均值的关键靶蛋白（AKT1、TP53、IL-6、CALM2、JUN），提示这些蛋白在益母草药理机制中发挥关键作用，见图2。

2.4 GO生物过程富集结果

对益母草216个靶基因进行GO生物过程富集，筛选到P<0.05的GO条目509个，按照P值由小到大排列的前20条主要生物过程见表3。主要涉及对体内外多种有机、无机物的反应，对缺氧的反应，细胞凋亡负调节，细胞增殖的正向调节，炎症反应，一氧化氮生物合成过程的正调节，信号转导等。

2.5 KEGG信号通路富集结果

对益母草216个蛋白进行KEGG信号通路富集，筛选出P<0.05的信号通路共7大类26条，按照P值由小到大排列，结果见表4。癌症相关通路6条：癌症的途径、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、癌症中的蛋白聚糖、癌症中的胆碱代谢；循环系统信号通路3条：补体及凝血级联反应、血小板激活、血管平滑肌收缩；糖尿病相关通路3条：胰岛素抵抗、II型糖尿病、I型糖尿病；炎症相关通路4条：TNF信号通路、TRP通道的炎症介质调控、Fcγ-R信号调理的吞噬、NF-κβ信号通路；5条信号通路：PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路、p53信号通路、钙信号通路、催产素信号通路；神经递质通路2条：5-羟色胺能突触、胆碱能突触；脂代谢通路2条：脂肪细胞因子信号传递途径、脂肪细胞中脂解的调节。涉及癌症、糖尿病、心血管疾病、炎症等。

3 讨论

本研究运用网络药理学方法筛选出益母草主要活性成分14种及靶点216个，KEGG分析显示靶基因主要分布于心血管、炎症、糖尿病、癌症等7大类26条通路。PPI网络分析发现多个与多种复杂疾病紧密相关的靶点，如AKT1编码的AKT蛋白。AKT是细胞生长信号通路中的传感器，在生长因子或胰岛素介导的信号转导中扮演重要的角色，在营养代谢、细胞生长、转录调控和细胞存活中也具有重要作用[10]。可见益母草的药理作用离不开这些关键靶蛋白的直接或者间接作用。

益母草有“血家圣药”“经产良药”之称，活血化瘀作用明显，其萜类活性成分能改变血液流变学、改善微循环、心肌缺血、抗血栓[11-13]，这与本研究KEGG富集分析得出的益母草靶点可富集在补体和凝血级联反应、血小板活化、血管平滑肌收缩等信号通路的结果相吻合。除影响血管平滑肌收缩外，益母草对子宫平滑肌具双向调节作用，如在产后出血中可联合缩宫素增强子宫收缩表现为止血作用[14-16]，而应用于痛经等疾病中则抑制子宫平滑肌收缩[17]。本研究发现益母草中鼬瓣花二萜、别香橙稀、前益母草二萜、异前益母草二萜、β-荜澄茄油烯、植醇、山柰酚、石竹素等成分能作用M1、M2、M3胆碱能受体。KEGG富集结果也有催产素信号通路、胆碱能突触信号通路、钙信号通路等决定子宫平滑肌收缩的主要通路。

本研究还发现，TNF信号通路、TRP通道的炎症介质调控、Fcγ-R信号调理的吞噬、NF-κβ信号通路等炎症方面通路，说明益母草中含有抗炎类化合物。王丽娟等[18]采用小鼠热板法和化学刺激法等发现益母草具有明显的镇痛、抗炎作用。其中萜类化合物通过作用于NF-κβ信号通路，下调一氧化氮合酶和环氧化酶蛋白质表达，致使脂多糖诱导的一氧化氮和前列腺素E2生成减少[19]。益母草中黄酮类物质也具有显著的抗炎作用，能够抑制肥大细胞和嗜碱性细胞释放慢反应致炎物质[20]。

此外，本研究益母草靶基因KEGG富集还得到多条癌症、糖尿病密切相关通路。宋霏[21]发现益母草水提物及益母草醇提物对人宫颈癌具有一定的体外抗肿瘤活性。而降糖作用未见报道，相关研究均处于探索阶段。

益母草成分复杂，药理作用多样，本研究基于网络药理学技术，初步分析其在血栓性疾病、妇产科疾病、炎症等方面的药效物质基础及分子机制。网络药理学作为中药研究的一种新方法，离不开相关数据库和技术手段的完善，而中药成分的发现也需要积累，现有数据库资料的完整性、准确性及实时更新等有待进一步加强。本研究单纯从网络药理学角度推测了益母草主要活性成分及药理机制，未将网络药理学所得结果进行实验验证，存在一定局限性，部分结论尤其是新发现抗癌及降糖作用仍需进一步验证。

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