生/制何首乌HPLC指纹图谱结合模式识别与含量测定的质量控制研究

林艳 刘月新 李春 肖榕 吴萍 张智敏 林丽美 廖端芳

摘要：目的 建立不同产地生/制何首乌的指纹图谱，结合模式识别与含量测定对其进行质量评价和鉴别。方法 采用HPLC对20批生/制何首乌进行检测，建立何首乌HPLC指纹图谱，运用相似度分析、主成分分析和正交偏最小二乘-判别分析对其进行评价，寻找生/制何首乌分类的主要贡献峰，并对主要差异性化学成分进行含量测定。结果 建立了生/制何首乌的HPLC指纹图谱，标定了10个共有峰，其中4个峰分别被指认为没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚，相似度在0.863～0.991之间；通过主成分分析和正交偏最小二乘-判别分析基本能区分生、制何首乌，并确定二苯乙烯苷和大黄素为生、制何首乌的主要差异性化学成分；生、制何首乌中二苯乙烯苷的含量分别为19.30～37.72 mg/g、7.50～18.26 mg/g，大黄素的含量分别为0.53～1.67 mg/g、0.11～0.50 mg/g。结论 指纹图谱结合模式识别与含量测定不仅可以实现何首乌质量整体信息的控制，而且能有效区分生、制何首乌。

关键词：何首乌；指纹图谱；二苯乙烯苷；大黄素；模式识别

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.016

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0062-05

Abstract： Objective To establish fingerprints of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb. from different producing areas； To identify and evaluate its quality by combining with pattern recognition and content determination. Methods HPLC was used to detect 20 batches of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.， and HPLC fingerprints of Polygonum multiflorum Thunb. were established. Similarity analysis， principal component analysis and orthogonal partial least squares-discrimination analysis were used to evaluate and find the main contribution peaks leading to the classification of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.， and content determination of main different chemical components was conducted. Results HPLC fingerprints of crude and processed Polygonum multiflorum Thunb. were established， and 10 common peaks were marked， 4 of which were referred to as gallic acid， stilbene， emodin and emodin methyl ether， respectively， with similarities between 0.863 and 0.991. Principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis could basically separate crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.， and stilbene and emodin were determined as the main different chemical components between crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.. The contents of stilbene in crude and processed Polygonum multiflorum Thunb. were 19.30–37.72 mg/g and 7.50–18.26 mg/g， respectively， and the contents of emodin were 0.53–1.67 mg/g and 0.11–0.50 mg/g， respectively. Conclusion Fingerprints combined with pattern recognition and content determination can not only realize the control of quality overall information of Polygonum multiflorum Thunb.， but also effectively separate crude and processed Polygonum multiflorum Thunb.

Keywords： Polygonum multiflorum Thunb.； fingerprints； stilbene； emodin； pattern recognition

何首烏为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根。生何首乌苦泄性平兼发散，具有解毒消痈、润肠通便、截疟功效；制何首乌味甘厚性温，具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨的作用[1]。现代研究表明，何首乌中主要含有二苯乙烯苷、蒽醌及鞣质等活性成分[2-3]。何首乌受产地、生长年限、采收时间、炮制加工、贮存等因素影响，其化学成分及质量存在一定的差异。

指纹图谱结合模式识别方法已被应用于药物的质量控制、差异标记物的筛选等方面[4-5]。何首乌药材指纹图谱目前已有文献报道，但仅涉及建立HPLC指纹图谱，或分析二苯乙烯苷含量与生/制何首乌分类及质量控制的关系[6-12]。因此，本研究建立生/制何首乌指纹图谱并对其进行模式识别，寻找导致生/制何首乌差别的主要贡献化合物，并对主要差异性化学成分进行含量测定，为何首乌质量整体控制及生/制何首乌的鉴别提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱系统（PDA检测器），安捷伦科技有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；CP114电子分析天平，上海奥豪斯仪器有限公司；0.22 ?m微孔滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司；RT-04A型高速粉碎机，香港泓荃制药机械公司。

没食子酸对照品（批号YA0505YA14，纯度≥98%）、大黄素对照品（批号P02N6F299，纯度≥98%）、大黄素甲醚对照品（批号P21S6F3673，纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司；二苯乙烯苷对照品（批号N1103AS，纯度≥98%），大连美仑生物技术有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。20批何首乌饮片购于其产地各省大药房和市场，所有样品均经湖南中医药大学药学院中药鉴定学教研室龚力民副教授鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，样品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Epic-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：甲醇（B）-水溶液（D），梯度洗脱（0～12 min，10%～40%B；12～20 min，40%～60%B；20～27min，60%～90%B；27～30min，90%～100%B；30～40min，100%B）；流速：1 mL/min；检测波长：264 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 ?L。

2.2 溶液的制备

2.2.1 4种化学成分对照品溶液的制备

分别取没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚浓度分别为0.34、3.68、0.36、0.91 mg/mL混合对照品溶液，用于指纹色谱峰确认。

2.2.2 2种化学成分对照品溶液的制备

分别取二苯乙烯苷、大黄素对照品适量，精密称定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制得对照品贮备液；取一定量对照品贮备液，用甲醇逐级稀释，得到二苯乙烯苷浓度分别为0.046、0.092、0.184、0.368、0.736、1.472 g/L，大黄素浓度分别为0.001 8、0.003 6、0.007 2、0.014 4、0.028 8、0.057 6 g/L的混合对照品溶液，用于含量测定。

2.2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末（过4号筛）约0.3 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，精密加入60%甲醇，超声（功率250 W，频率40 kHz）提取30 min，放冷，再称定质量，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 ?m微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度試验

取同一批样品粉末（S9），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以第1次进样所得指纹图谱作为对照图谱计算相似度，其相似度均大于0.99，表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取同一批样品粉末（S9），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，以0 h所得指纹图谱为对照，各指纹图谱相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取同一批样品粉末（S9），按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进行指纹图谱测定，其指纹图谱相似度均大于0.97，表明本方法重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立及分析

按“2.2.3”项下方法制备20批何首乌供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，采集40 min色谱图，剔除因流动相梯度变化而出现的不规则色谱峰，选择峰面积最大、出峰时间最稳定的5号峰为作为参照峰，分别计算其他共有峰相对峰面积，结果见表2。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2010版）》进行数据处理，生成何首乌指纹图谱。根据20批样品测定结果，标定了10个共有峰，指认了3、5、9、10号4个色谱峰，分别为没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚。结果见图1。

2.3.5 何首乌相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2010版）》对20批何首乌指纹图谱进行相似度分析，结果20批样品的相似度分别为0.884、0.996、0.975、0.984、0.990、0.970、0.982、0.970、0.985、0.986、0.971、0.983、0.988、0.985、0.957、0.976、0.983、0.863、0.962、0.991，均大于0.85，具有良好的相似度，表明不同批次的何首乌化学成分组成基本一致，质量稳定。但不同批次各色谱峰的峰面积存在差异，说明各化学成分含量具有一定的差异。

2.4 化学模式识别

2.4.1 主成分分析

采用主成分分析（PCA）对20批何首乌样品建模，以共有峰峰面积为自变量（以出峰时间标记峰的归属），以不同批次何首乌为因变量（Y），将数据导入Simca13.0软件进行分析，从PCA得分图可见，20批何首乌大致可分为2类，见图2。

2.4.2 正交偏最小二乘法-判别分析

运用正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）建立生/制何首乌HPLC指纹图谱差异模型。结果表明，该方法能够很好地将生/制何首乌分成2类，见图3。根据VIP>1.5、P<0.05的变量来筛选导致差异性的主要化学成分，发现5号峰二苯乙烯苷（Rt=19.228）和9号峰大黄素（Rt=33.018）为生/制何首乌最主要的差异性化学成分，见图4。

2.5 特征成分含量测定

2.5.1 线性关系考察

取一定量对照品溶液，在上述色谱条件下进样分析，记录相应峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算。结果二苯乙烯苷回归方程为Y=3083.2X-34.1，r=0.999 0，在0.23～7.36 ng范围内线性关系良好；大黄素回归方程为Y=17 103X-12.46，r=0.999 2，在0.009～0.288 ng范围内线性关系良好。

2.5.2 加样回收率试验

取同一批样品粉末（S9）6份，每份0.15 g，精密称定，按相当于样品中二苯乙烯苷、大黄素测定量100%加入相应对照品，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进行含量测定，计算加样回收率，结果见表3。

2.5.3 样品含量测定

分别取20批何首乌样品粉末，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进行含量测定，计算样品中二苯乙烯苷和大黄素含量，结果见图5、图6。20批样品中，二苯乙烯苷在生何首乌中含量为19.30～37.72 mg/g（1.9%～3.8%），在制何首乌中含量为7.50～18.26 mg/g（0.7%～1.8%）。2015年版《中华人民共和国药典》规定，二苯乙烯苷在生何首乌中含量不得低于1.0%，在制何首乌中含量不得低于0.7%。据此判断，20批样品均为合格品，与指纹图谱相似度分析结果一致。此外，由于生何首乌中二苯乙烯苷的含量在1.9%以上，而制何首乌中二苯乙烯苷的含量在1.9%以下，据此可以区分生、制何首乌。20批样品中，大黄素在生何首乌中含量为0.53～1.67 mg/g（0.05%～0.17%），在制何首乌中含量为0.11～0.50 mg/g（0.01%～0.05%），可见，生何首乌中大黄素含量在0.05%以上，制何首乌中大黄素含量在0.05%以下，据此也可区分生、制何首乌。上述二苯乙烯苷和大黄素含量测定结果与指纹图谱模式识别结果一致，两者可相互验证。

图5 20批何首乌中二苯乙烯苷和大黄素含量测定结果

3 讨论

本试验对样品提取方法（超声、回流）、提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇）、提取时间（15、30、45 min）、流动相（甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.05%甲酸）、波长（280、235、264 nm）、色谱柱（Agilent Zorbax Sb-C18，Agilent Eclipse Xdb-C18，Epic-C18）进行了详细考察，确定了样品处理方法和色谱条件，在此条件下色谱峰较多，分离效果较好。

本试验建立了生/制何首乌HPLC指纹图谱，标定了10个共有峰，指认了其中4个色谱峰。通过模式识别分析方法，建立了生/制何首乌的分类模型，并确定二苯乙烯苷和大黄素是生/制何首乌中最主要的差异性化学成分。另外，也可根据何首乌中二苯乙烯苷和大黄素的含量测定结果区分生/制何首乌。本试验建立的指纹图谱和含量测定方法，不仅能体现何首乌的整体质量，也可有效区分生、制何首乌，为何首乌的质量控制提供参考。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：175-177.

[2] LIN L F， NI B， LIN H M， et al. Traditional usages， botany， phytochemistry， pharmacology and toxicology of Polygonum multiflorum Thunb.：a review[J]. Ethnopharmacol，2014，159（22）：158.

[3] 高淑红，苏珍枝，肖学凤.制首乌化学成分及药理作用研究进展[J].山西中医学院学报，2012，23（2）：6-10.

[4] PENG Q， TIAN R， CHEN F， et al. Discrimination of producing area of Chinese Tongshan kaoliang spirit using electronic nose sensing characteristics combined with the chemometrics methods[J]. Food Chem，2015，178：301.

[5] 夏伯候，严东，曹艺，等.不同剂型夏桑菊颗粒HPLC指纹图谱及其模式识别分析[J].中国中药杂志，2016，41（3）：416-420.

[6] 肖榕，林艳，雷思敏，等.UPLC指纹图谱结合模式识别分析不同产地生/制何首乌[J].中国中药杂志，2017，42（12）：2305-2310.

[7] 杨满琴，谢若男，徐玥玮，等.多产地何首乌药材质量的HPLC指纹图谱评价研究[J].广州化工，2017，45（17）：96-98.

[8] 焦豪妍，王英，陈丽莉，等.广东道地药材何首乌HPLC指纹图谱研究[J].中国药业，2014，23（23）：58-61.

[9] 李帅锋，郑传柱，张丽，等.不同产地何首乌HPLC指纹图谱研究[J].中草药，2015，46（14）：2149-2154.

[10] 金嘉文，陈有军，刘梅，等.何首乌与制何首乌补血作用及HPLC指纹图谱的比较[J].中國实验方剂学杂志，2013，19（8）：206-209.

[11] 罗文，刘斌，王伟，等.何首乌药材HPLC指纹图谱研究[J].北京中医药大学学报，2008，31（8）：557-560.

[12] 武政，张勉，张朝凤，等.36批何首乌药材质量的HPLC指纹图谱评价研究[J].中国药学杂志，2006，41（4）：257-260.