甘草次酸与茶碱联用的体内及体外平喘作用研究

尉捷 张奇

摘要：目的 探究甘草次酸与茶碱联合使用的体内、体外平喘作用机制。方法 实验分为空白对照组、模型组、甘草次酸组、不同浓度茶碱组及甘草次酸+茶碱组，ELISA检测人支气管平滑肌细胞炎症模型细胞内环磷酸腺苷（cAMP）变化；建立离体气管体外模型，比较药物改善乙酰胆碱引发的气管收缩率；建立豚鼠哮喘模型，测定豚鼠延喘时间。结果 各浓度茶碱均可升高细胞内cAMP含量，抑制乙酰胆碱引起的体外气管收缩，延长延喘时间，差异均有统计学意义（P<0.05）；甘草次酸单独使用时无显著效果；当二者联合使用时，甘草次酸+茶碱组与相同浓度茶碱组比较，cAMP含量升高，气管收缩率降低，延喘时间增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 甘草次酸与茶碱在平喘治疗中联用，可提高药效，减少茶碱使用量。

关键词：茶碱；甘草次酸；平喘；气管平滑肌；豚鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0045-03

Abstract： Objective To investigate the mechanism of glycyrrhetic acid combined with theophylline for in vivo and in vitro combating asthma. Methods The experiment was divided into blank control group， model group， glycyrrhetic acid group， different concentrations of theophylline groups and glycyrrhetic acid + theophylline group. The intracellular cAMP changes were measured by ELISA method. An in vitro tracheal model was established to compare the effects of medicine on acetylcholine-induced muscle contraction. Guinea pig asthma model was established， and asthmatic time in guinea pigs was detected. Results Theophylline high， medium， and low concentrations could increase intracellular cAMP levels， inhibit acetylcholine-induced tracheal contractions in vitro， and prolong the delay time for asthma， with statistical significance （P<0.05）； The glycyrrhetic acid has no significant effect when used alone； When glycyrrhetic acid combined with theophylline， compared with theophylline group of the same concentration， the glycyrrhetic acid + theophylline group had higher cAMP content， lower tracheal contraction rate， and longer delay time for asthma， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Glycyrrhetic acid combined with theophylline used in combating asthma can improve efficacy and reduce the dosage of theophylline.

Keywords： theophylline； glycyrrhetic acid； combating asthma； tracheal smooth muscle； guinea pig

茶碱（theophylline）是茶叶中的重要成分，是一种磷酸二酯酶（PDE）抑制剂，常用于哮喘治疗，有舒张支气管平滑肌作用，在血浆浓度小于10 mg/L时即可对迟发型哮喘反应产生影响，但由于其非选择性抑制，对中枢神经、心血管及胃肠道等系统均表现出一定的不良反应，限制了其临床应用[1]。甘草作为一种补益类中药，有调和诸药之效。甘草含有多种化学成分，其中甘草次酸（glycyrrhetic acid）作为甘草类化合物发挥实质功效的重要中间物质，有显著的肾上腺皮质激素样作用，具有抗炎、增强机体免疫力、提高生理机能、抑制癌细胞生长等功效，常用于各种原因引起的上呼吸道感染[2-5]。甘草次酸经肠内微生物作用，部分生成3-表-甘草次酸及少量3-脱氢甘草次酸，进而发挥其活性[6]。本研究分别在细胞、离体组织和动物水平，研究甘草次酸与茶堿联合使用在平喘中的作用，以期在提高或保持茶碱类药物原有治疗效果的情况下，减少茶碱使用量，进而降低其毒副作用，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞株

SPF级英国种豚鼠（短毛种）48只，2月龄，体质量（350±10）g，雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2008- 0003。饲养于温度（21±2）℃、相对湿度30%～70%的环境，每日光照12 h，通风良好，自由摄食饮水。人支气管平滑肌细胞株（human bronchial smooth muscle cells，HBSMC），美国Sciencell公司。

1.2 药物

甘草次酸（编号588965）、茶碱（编号340523）、磷酸组胺（编号H7375）、乙酰胆碱（编号A0084），百灵威科技有限公司。

1.3 主要试剂与仪器

平滑肌细胞培养基（SMCM），美国Sciencell公司；环磷酸腺苷（cAMP）ELISA试剂盒，美国BioVision公司；Krebs-Henseleit缓冲液，美国Sigma公司。酶标仪（美国Bio-rad公司），恒温平滑肌槽、张力传感器、生物信号采集系统（成都盟泰科技有限公司），超声波雾化器（北京亚都科技股份有限公司）。

1.4 细胞药物处理

将复苏后的HBSMC以SMCM稀释至106/mL，加入96孔板，100 ?L/孔，37 ℃、5%CO2培养，待细胞生长至80%～90%时，将其分为9组。模型组加入终浓度10 ?g/mL肿瘤坏死因子-α（TNF-α）；空白对照组用SMCM；药物干预组分别在加入终浓度10 ?g/mL TNF-α后再加入不同浓度药物，甘草次酸组加入终浓度10-9 mol/L甘草次酸，茶碱低、中、高组分别加入终浓度10-9、10-8、10-7 mol/L茶碱，甘草次酸+茶碱低、中、高组分别加入终浓度10-9、10-8、10-7 mol/L茶碱和10-9 mol/L甘草次酸。每组用8个平行，37 ℃、5%CO2孵育12 h。

1.5 环磷酸腺苷测定

参照cAMP ELISA试剂盒说明书，倾倒上述细胞的培养液，加入150 ?L裂解液，充分裂解、静置后，吸取100 ?L上清液加入固定有cAMP抗体的酶标板。再加入100 ?L HRP-cAMP，37 ℃孵育1.5 h，磷酸盐缓冲液充分洗涤，然后加入显色液显色，于450 nm波长处测定吸光度。以空白对照组为单位1（100%），以与空白对照组比值×100%计算cAMP，以模型组和各给药组与空白对照组比值表示cAMP的变化情况。

1.6 豚鼠离体气管收缩实验

选6只豚鼠，击头致昏，剥取气管后，将每只豚鼠气管剪成4 mm×8 mm的气管片，分别固定于Krebs-Henseleit缓冲液（20 mL）、37 ℃恒温管中，并与张力传感器连接，持续通入95%O2和5%CO2的混合气体，静息负荷1 g重物后，加入10-5 mol/L乙酰胆碱，以生物信号采集系统收集数据，记录最大收缩效应，作为空白对照组。随后，以Krebs-Henseleit缓冲液反复冲洗该气管片，直至肌张力恢复至基线，按“1.4项”下药物处理分别加入待测药物和10-5 mol/L乙酰胆碱，以生物信号采集系统收集数据，测量收缩曲线，计算收缩率[7]。收缩率（%）=（给药前曲线高度-给药后曲线高度）÷给药前曲线高度×100%。

1.7 磷酸组胺致敏豚鼠哮喘实验

将雌雄各半42只豚鼠逐个标记后置玻璃钟罩内，用超声波雾化器喷入（0.5 mL/min）0.1%磷酸组胺+2%乙酰胆碱溶液10 s引喘，以秒表记录每个豚鼠发生哮喘时间。将豚鼠随机分为空白对照组（予生理盐水），甘草次酸（0.5 mg/kg）组，茶碱高（5 mg/kg）、中（2.5 mg/kg）、低（1.25 mg/kg）组，甘草次酸+茶碱中、低组，每组6只，雌雄各半，用超声波雾化器喷入（0.5 mL/min）不同浓度和配比的药物，连续喷雾10 s后，用超声波雾化器以相同的速度喷入0.1%磷酸组胺+2%乙酰胆碱溶液10 s引喘，以秒表记录豚鼠哮喘潜伏时间，计算延喘时间百分比[8]。

1.8 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。采用方差分析，组间两两比较用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甘草次酸与茶碱联用对人支气管平滑肌细胞株细胞内环磷酸腺苷水平的影响

与模型组比较，茶碱高、中、低组cAMP水平显著升高（P<0.05），甘草次酸组升高不明显（P>0.05），当二者联合使用时，与单独使用相同浓度茶碱组比较，cAMP比例显著升高（P<0.05）。见图1。

2.2 甘草次酸与茶碱联用对豚鼠离体气管收缩的影响

高、中、低浓度茶碱组均呈剂量依赖性地抑制气管收縮（P<0.05）；甘草次酸组与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；中、低浓度茶碱与甘草次酸联合使用时，与相同浓度茶碱组比较，可显著抑制气管收缩（P<0.05）。见表1。

2.3 甘草次酸与茶碱联用对组胺致敏豚鼠抗哮喘作用的影响

茶碱高、中、低组均呈剂量依赖性地延长豚鼠延喘时间（P<0.05）；甘草次酸组与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；中、低浓度茶碱与甘草次酸联用时，与相同浓度茶碱组比较，可显著延长豚鼠延喘时间（P<0.05）。见表2。

3 讨论

受cAMP调控的蛋白激酶A（PKA）在气道平滑肌中活化后可影响多种蛋白的磷酸化，包括可抑制肌球蛋白轻链激酶，从而抑制肌动蛋白与肌球蛋白偶联，使气道平滑肌松弛；PKA活化还可促进钙激活钾通道，钾离子外流导致气道平滑肌细胞膜超极化，抵消跨壁张力引起的膜去极化及平滑肌收缩；PKA活化也抑制磷脂酰肌醇水解，从而降低细胞内游离Ca2+，阻断依赖Ca2+的气道平滑肌收缩反应[9]。

当PDE被抑制时，细胞内cAMP显著升高，进而使气道舒张。茶碱作为一种非特异性的PDE抑制剂可抑制其活性，使cAMP水平及cAMP/cGMP比值升高，抑制细胞Ca2+内流，促进Ca2+外排，降低细胞内Ca2+水平，从而扩张支气管平滑肌[10]。因此，药物作用后cAMP水平可直接代表药物活性水平。

本实验结果表明，在细胞水平，甘草次酸和茶碱联合使用时，其胞内cAMP累计效果优于单独使用相同浓度茶碱；豚鼠离体气管收缩实验和豚鼠磷酸组胺引喘活体实验表明，甘草次酸与茶碱联用均可显著增强茶碱的平喘效果。

综上，甘草次酸与茶碱联合使用，可有效升高茶碱平喘活性，进而降低茶碱的使用量。尽管二者联用可降低茶碱的使用量，但其具体的协同增效机制目前尚不清晰，有待后续进一步深入研究。

参考文献：

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[9] TORPHY T J. Beta-adrenoceptors， cAMP and airway smooth muscle relaxation：challenges to the dogma[J]. Trends Pharmacol Sci， 1994，15（10）：370-374.

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