高效液相色谱-串联质谱法测定蜂胶及以其为原料的保健食品中的氯霉素

温家欣, 吴凤丹, 曹雅静, 何嘉雯, 黄志业, 黄艳婷, 谭婉清, 罗文静, 赖宇红

(广东省药品检验所, 广东 广州 510663)

蜂胶是工蜂采集植物树脂等分泌物后与自身上颚腺、蜡腺等分泌物混合而成的胶黏性物质[1]。蜂胶是传统中药,具有多种生物学活性,如抗氧化、抗炎、抑菌、免疫调节、保肝护肝、抗癌等[2],广泛应用于保健食品、药品和化妆品等行业中,是近十多年来蜂产品乃至天然产物研发的热点之一[3]。自2002年我国出口欧盟的蜂蜜检出氯霉素后,我国蜂产品的出口贸易形势比较严峻,蜂产品中的兽药残留问题已成为影响其食用安全最主要的因素,成为学术界的研究热点。

氯霉素是一种广谱抗生素,是预防和治疗蜜蜂细菌性疾病的有效药物之一。但由于氯霉素能在蜂产品中残留,对人类的造血系统有严重不良反应,许多国家已将其列入食品中禁止使用的药物名单[4]。目前,关于蜂蜜、蜂王浆及其相关制品中氯霉素残留量检测方法的报道较多,主要有高效液相色谱-串联质谱法[5,6]、气相质谱法[7]、酶联免疫法[8]等,但关于蜂胶及以其为原料的保健食品的报道较少[4,9-11]。对于蜂胶原料,普遍采用氢氧化钠溶液、乙醇、甲基叔丁基醚溶解,以乙酸铅溶液、氢氧化钠溶液为沉淀剂去除黄酮,最后以乙酸乙酯萃取的方法进行前处理[4,9,10]。对于以蜂胶为原料的保健食品,其主要剂型为软胶囊和硬胶囊,由于制剂辅料(如聚乙二醇400、明胶、甘油、植物油、淀粉、微晶纤维素等)的加入,其样品基质更为复杂。对于软胶囊剂,部分辅料(如聚乙二醇400)的添加量较大,溶解特性与氯霉素相似,使用常用的氯霉素提取溶剂(乙酸乙酯、乙腈等)将产生较严重的共提取,导致样品难以浓缩[11],影响方法的灵敏度和抗干扰性;对于硬胶囊剂,部分辅料(如淀粉、微晶纤维素等)遇极性较低的有机溶剂容易产生胶状物,不利于氯霉素的提取。因此,选择合适的提取溶剂、净化手段和萃取溶剂,是前处理方法研究的重点。

本文根据蜂胶原料及以蜂胶为原料的保健食品的基质特点,开发了一个同时适用于这两类样品的氯霉素测定方法。本方法具有操作简便、灵敏度高、抗干扰能力强、定性定量准确、推广应用前景良好的优点,为蜂胶产品氯霉素残留监管问题提供了有效的技术支撑手段。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-20ADXR液相色谱系统(日本Shimadzu公司), Triple Quad 5500串联四极杆质谱仪(配ESI)(美国Sciex公司), MS 3 digital涡旋振荡器(德国IKA公司), ST16R离心机(美国Thermo Fisher公司), Hei-VAP Advan旋转蒸发仪(德国Heidolph公司), Mili-Q Advantage A10超纯水发生器(美国Millipore公司)。

氯霉素标准物质(CAP,纯度99.0%)和氯霉素-D5标准物质溶液(CAP-D5, 100 mg/L)(德国Dr. Ehrenstorfer公司);无水乙醇、三水合乙酸铅、冰醋酸、氨水、正己烷(分析纯,广州光华试剂厂);甲基叔丁基醚和乙腈(色谱纯,美国Honeywell公司)。

1.2 实验条件

1.2.1HPLC-MS/MS条件

色谱柱:Thermo Accucore C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);流速:0.3 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:10 μL;流动相:A为水,B为乙腈;梯度洗脱程序:0～2.0 min, 20%B; 2.0～5.0 min, 20% B～90%B; 5.0～7.0 min, 90%B; 7.0～7.5 min, 90%～20%B; 7.5～10.0 min, 20%B。

采用ESI源,负离子模式检测。电喷雾电压:-4 500 V;离子源温度:550 ℃;雾化气压力:3.447 5×105Pa;气帘气压力:2.758×105Pa;碰撞气压力:6.205 5×104Pa;检测方式:多反应监测(MRM)。其他质谱条件见表1。

表 1 氯霉素、氯霉素-D5 的质谱参数

* Quantitative ion.

1.2.2溶液配制

4%(质量分数,下同)乙酸铅溶液:称取20 g三水合乙酸铅,用水溶解,加入2.5 mL冰醋酸,加水至500 mL,混匀。

准确称取10 mg氯霉素标准物质,用乙腈配成500 mg/L的标准储备溶液。准确移取适量氯霉素-D5标准物质溶液,用乙腈稀释成100 μg/L的内标工作溶液。

取适量氯霉素标准储备溶液、氯霉素-D5内标工作溶液,用乙腈-水(1∶1, v/v)配制成氯霉素质量浓度为0.20～50.0 μg/L、内标氯霉素-D5质量浓度为10 μg/L的标准工作曲线。

1.2.3样品前处理

将蜂胶原胶置于-18 ℃冷冻2 h,取出后立即敲碎,敲碎后的样品作为供试样品。以蜂胶为原料的保健食品直接取胶囊内容物。

称取试样2.00 g,置于50 mL离心管中,加入100 μL氯霉素-D5工作溶液(100 μg/L)和无水乙醇(蜂胶、硬胶囊加4 mL,软胶囊加2 mL),涡旋振荡10 min(硬胶囊经无水乙醇提取后需以8 000 r/min的速度离心10 min,上清液用滤纸过滤至另一50 mL离心管中,滤纸上的残渣用1～2 mL无水乙醇洗涤,滤液备用)。加入10 mL水,涡旋3 min,再加入10 mL 4%乙酸铅溶液,涡旋3 min,以8 000 r/min的速度离心5 min。上清液倾入另一50 mL离心管中,残渣加入5 mL 4%乙酸铅溶液,涡旋3 min,以8 000 r/min的速度离心5 min,合并上清液于同一50 mL离心管。上述清液用氨水调节pH至10～11,混匀后静置5 min,以8 000 r/min的速度离心5 min。上清液倾入50 mL离心管中,加入10 mL正己烷,涡旋振荡5 min,以8 000 r/min的速度离心5 min,弃去上层溶液。再加入10 mL甲基叔丁基醚,涡旋振荡5 min,以8 000 r/min的速度离心5 min,取上层清液于鸡心瓶。重复提取1次,合并提取液于同一鸡心瓶。于40 ℃水浴中旋转蒸发至干,加入1 mL乙腈-水(1∶1, v/v)复溶。复溶液通过0.22 μm有机相滤膜至样品瓶,待测。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

蜂胶可溶于2%氢氧化钠溶液、乙醇[9],氯霉素易溶于甲醇、乙醇、丁醇、乙酸乙酯、丙酮。由于硬胶囊剂一般使用淀粉作为内容物辅料,使用2%氢氧化钠溶液、0.5%氢氧化钙悬浊液[11]处理,会使淀粉发生糊化,导致氯霉素包裹其中,严重影响试样中氯霉素的提取。而无水乙醇能有效溶解蜂胶,但不溶解硬胶囊剂常用辅料(淀粉、微晶纤维素等)和软胶囊剂常用辅料(明胶),通过离心、过滤即可去除大量辅料成分的共提取。为提高前处理方法的通用性,降低后续净化处理的难度,本方法采用无水乙醇对蜂胶及以蜂胶为原料的保健食品中的氯霉素进行提取。

2.2 净化方式的选择

蜂蜜、蜂王浆样品的净化过程主要采用液液萃取[6,12,13]、固相萃取[14-16]、液液萃取与固相萃取相结合[5,17]、QuEChERS[18,19]等方式净化。但由于蜂胶的成分与蜂蜜、蜂王浆有很大的差别,基质更加复杂,使用液液萃取的方式不能除去蜂胶中的大量黄酮类成分[4]。以蜂胶为原料的软胶囊剂保健食品,由于制剂辅料(如聚乙二醇400、甘油)的大量加入,使氯霉素在固相萃取柱、分子印迹柱中的保留行为发生变化。因此,本方法采用4%乙酸铅溶液沉淀具有邻二酚羟基结构的黄酮类干扰物[4],在碱性条件下进一步去除不含此结构的黄酮类干扰物[9],同时,碱性条件下更利于后续有机溶剂对氯霉素的萃取。另外,由于蜂胶约含30%蜂蜡,以蜂胶为原料的软胶囊剂保健食品常以植物油(如大豆油、玉米油等)作为辅料,因此本方法使用正己烷去除样品中蜡质、脂类及脂溶性杂质的干扰。

2.3 萃取溶剂的选择

针对氯霉素常用的萃取溶剂主要有乙酸乙酯、乙腈、碱性乙酸乙酯和碱性乙腈[20]。对于软胶囊剂,聚乙二醇400是常用的制剂辅料,是一种非离子型的水溶性聚合物,在极性较大的溶剂中有很好的溶解性,且添加量较大,使用乙酸乙酯、乙腈等作为萃取溶剂会产生严重的共提取,导致样品难以浓缩[11],影响方法的灵敏度,带来严重的基质干扰。因此,选择一种合适的萃取溶剂至关重要。本方法采用甲基叔丁基醚作为溶剂,在碱性条件下对净化液中的氯霉素进行萃取,有效减少样品中极性干扰物和制剂辅料(聚乙二醇400、甘油等)的共提取。

2.4 线性范围、检出限与定量限

配制质量浓度为0.20～50.0 μg/L的氯霉素标准工作溶液,以氯霉素与氯霉素-D5的峰面积比值为纵坐标y、氯霉素的质量浓度为横坐标x(单位:μg/L)进行线性回归,回归方程为y=0.083 9x-0.011 9,相关系数r=0.999 8,线性关系良好。在空白基质溶液中添加不同浓度的氯霉素标准溶液,按取样量2.0 g、定容体积为1 mL计算,当信噪比(S/N)≥3时,氯霉素标准溶液质量浓度为0.06 μg/L,方法检出限为0.03 μg/kg;当S/N≥10时,氯霉素标准溶液浓度为0.20 μg/L,方法定量限为0.1 μg/kg。

2.5 方法学考察

由于蜂胶原料、以蜂胶为原料的保健食品的基质差异较大,保健食品不同剂型的制剂辅料的组成差异显著,应分别对蜂胶原胶、以蜂胶为原料的保健食品(硬胶囊剂)、以蜂胶为原料的保健食品(软胶囊剂)3类样品进行考察。其中,由于软胶囊剂中常见的制剂辅料聚乙二醇400与蜂蜡、植物油等低极性辅料不配伍,所以以蜂胶为原料的软胶囊通常有两种辅料配伍方式,一种是含有聚乙二醇400但不含蜂蜡、植物油等低极性物质,另一种是含有蜂蜡、植物油但不含聚乙二醇400。本文对上述4种基质进行考察,各基质在低、中、高3个水平的加标回收率见表2,回收率为86.0%～114.4%。

PEG 400: polyethylene glycol 400.

2.6 基质效应评价

基质效应是由基质中的共提取干扰物与目标化合物竞争电离所致[21]。为评价基质效应,本文使用4种不同基质的空白基质溶液配制成质量浓度为0.20～50.0 μg/L的标准工作溶液,以外标法制作标准曲线,采用(基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1)×100%进行评价,负值表示存在抑制效应,正值表示存在增强效应,绝对值越大表示基质效应越强[22]。由表3可见,不同基质的样品,基质效应均小于7%,表明基质效应较弱,本方法具有良好的净化效果。

2.7 实际样品检测

应用本方法对5批不同厂家蜂胶原料、18批以蜂胶为主要原料的保健食品进行检测。其中,蜂胶原料均未检出氯霉素;5批以蜂胶为原料的保健食品(1批硬胶囊和4批软胶囊)检出氯霉素,阳性率为27.7%,含量为0.23～21.66 μg/kg,结果见表4。氯霉素标准溶液及典型样品提取离子流色谱图见图1。

表 3 4种不同基质的基质效应评价

表 4 23批样品中氯霉素含量测定结果

表 4 (续)

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图 1 氯霉素标准溶液及典型样品提取离子流(XIC)色谱图

3 结论

本文根据蜂胶原料及以蜂胶为原料的保健食品的基质特点,开发了同时适用于这两类样品的氯霉素测定方法。以乙酸铅溶液沉淀具有邻二酚羟基结构的黄酮类干扰物,在碱性条件下进一步去除不含此结构的黄酮类干扰物,并以甲基叔丁基醚为提取溶剂,有效减少样品中极性干扰物和保健食品辅料(如聚乙二醇、甘油等)的共提取,具有通用性强、操作简便、灵敏度高、抗干扰能力强、推广应用前景良好的优点,可满足实际检验工作的需要。