超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定克氏螯虾中39种兽药残留

宋 伟, 赵暮雨, 韩 芳, 吕亚宁, 丁 磊, 周典兵, 邓晓军, 胡艳云*, 郑 平, 盛 旋

(1. 安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 安徽 合肥 230022; 2. 食品安全分析与检测安徽省重点实验室,安徽 合肥 230022; 3. 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心, 上海 200135)

克氏原螯虾又称红螯虾、淡水小龙虾,是市场上深受欢迎的水产食品,同时也是我国重要的出口产品,而药物残留是当前影响克氏原螯虾养殖质量安全的关键危害因子[1,2],根据我国农业部235号公告规定,磺胺类药物在克氏原螯虾肌肉组织中的总量不得超过100 μg/kg,恩诺沙星与环丙沙星之和不得超过100 μg/kg,达氟沙星不得超过100 μg/kg,二氟沙星不得超过300 μg/kg,并禁止使用孔雀石绿。目前针对动物源性产品中药物残留的检测方法主要有酶联免疫法[3,4]、液相色谱法[5-7]、液相色谱-串联质谱法[8-11]等,但这些方法所能检测的目标物数量及确证能力有限。其中酶联免疫法检测结果易受试剂质量的影响,对结构类似物有一定程度的交叉反应,容易出现假阳性;液相色谱法灵敏度较低,选择性和特异性较差;液相色谱-串联质谱法虽然方法灵敏度和特异性都比较高,但由于难以完全阐明化合物的结构裂解信息,定性准确度方面尚有欠缺;另外受通道驻留时间限制,能同时检测的化合物数量有限。而超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF/MS)作为一种结合了超高效液相色谱高分离能力和四极杆飞行时间质谱高分辨功能的联用技术,不仅可以提供母离子的精确相对分子质量,还可以提供大量二级碎片离子及其精确分子质量信息,预测元素组成并辅助结构鉴定,大大提高了复杂背景下的抗干扰能力,使检测结果更加准确,具有选择性高、受基质干扰小、方法建立过程简单等优点[12-15],理论上可以分析的化合物没有数量限制,能为水产品中大量药物及污染物筛查分析提供更具优势的筛查技术手段。

样品前处理技术是兽药残留分析的关键步骤,直接影响检测结果。QuEChERS作为一种简单、快速、高效的药物多残留的前处理方法,近些年已被引入兽药残留分析[16-18],其常规净化吸附剂主要包括C18、N-丙基乙二胺粉末(PSA)、石墨化炭黑等。随着技术的快速发展,目前一些新型材料也被应用于QuEChERS方法,以有效去除样品中的脂肪、蛋白质、色素等杂质。如EMR-Lipid作为QuEChERS增强型脂质去除产品,已有研究表明其能高效并选择性地去除高脂肪食品中的脂质[18-20]。另外,随着纳米技术的快速发展,石墨烯[21]、多壁碳纳米管[22,23]等一些新型纳米吸附剂填料也在QuEChERS技术中得到了应用研究。将新型高效净化吸附剂结合QuEChERS法应用于水产品中兽药的残留分析,将有效提高样品前处理速度及净化效果。

本文采用增强型脂质去除净化剂(EMR-Lipid,简称EMR)结合石墨化多壁碳纳米管作为QuEChERS法吸附剂对克氏螯虾样品进行前处理,同时采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术建立喹诺酮类、磺胺类、三苯甲烷类39种药物残留一级精确质量数据库及二级碎片谱图库。通过比对准分子离子的精确质量数、同位素丰度比、保留时间等信息对目标物进行初筛,之后通过二级谱图谱库检索比对进行确证,最终以一级提取离子色谱图峰面积进行定量,建立适合于克氏螯虾中39种兽药残留检测的快速筛查方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290-6540超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪(Agilent,美国); Avanti J-E高速冷冻离心机(Beckman Coulter,美国); N-EVAP112氮吹浓缩仪(OA-SYS,美国); PL602-L电子天平(Mettler,德国); T25均质器(IKA,德国); Vortex-Genie 2涡旋混匀器(Scientific Industries,美国); Milli-Q超纯水机(Merck Millipore,美国)。

标准品:磺胺醋酰(sulphacetamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺噻唑(sulfathiazole)、磺胺吡啶(sulfapyridine)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)、三甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)、磺胺二甲嘧啶(sulfadimidine)、磺胺甲氧哒嗪(sulfamethoxypyridazine)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、磺胺对甲氧嘧啶(sulfameter)、磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)、磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine)、磺胺甲基异恶唑(sulfamethoxazole)、磺胺二甲异恶唑(sulfisoxazole)、磺胺苯酰(sulfabenzide)、磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)、磺胺喹恶啉(sulfachinoxalin)、磺胺苯吡唑(sulfaphenazole)、磺胺硝苯(sulfanitran)、麻保沙星(marbofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、氟罗沙星(fleroxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、丹诺沙星(danofloxacin)、恩诺沙星(enrofloxacin)、奥比沙星(orbifloxacin)、沙拉沙星(sarafloxacin)、双氟沙星(difloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、氟甲喹(flumequine)、恶喹酸(oxolinic acid)、萘啶酸(nalidixic acid)、孔雀石绿(malachite green)、隐色孔雀石绿(leucomalachitegreen)、结晶紫(crystal violet)、隐色结晶紫(leucocrystalviolet)(纯度≥99%,德国Dr. Ehrenstorfer公司);甲酸、乙酸、乙腈(色谱纯,美国Tedia公司);氯化钠、无水硫酸镁、乙酸铵(分析纯,国药集团化学试剂有限公司); PSA、C18吸附剂(美国Waters公司);EMR-Lipid(美国Agilent公司);石墨化多壁碳纳米管(直径>50 nm,长度:10～20 μm,纯度>99.9%,南京先丰纳米材料科技有限公司)。

兽药标准溶液:准确称取上述39种兽药标准品各10 mg(精确至0.1 mg),分别置于10 mL棕色容量瓶中,用乙腈溶解并定容,标准储备液浓度均为1 mg/mL,于-18 ℃避光保存。实验中根据每种目标化合物的定量限,用空白样品提取液逐级稀释配制成不同浓度的系列基质混合标准工作液,现用现配。

1.2 样品前处理

将克氏螯虾样品去头、去壳,取可食部分用匀浆机制样,于-18 ℃冷冻贮存备用。称取4 g(精确至0.01 g)样品于50 mL离心管中,加入10 mL 1%(v/v)甲酸乙腈溶液,13 500 r/min均质提取1 min,于-4 ℃、10 000 r/min冷冻离心20 min。取5 mL上清液至预先用5 mL水浸润活化过的EMR-Lipid管中,涡旋振荡2 min,之后于4 ℃条件下10 000 r/min离心5 min。取上清液5 mL移入加有0.5 g氯化钠、2.0 g无水硫酸镁的反萃管中,涡旋振荡1 min后,于4 ℃条件下10 000 r/min离心5 min,再将上层乙腈层转移至加有30 mg石墨化多壁碳纳米管的净化管中,涡旋振荡2 min,于4 ℃条件下10 000 r/min离心5 min。最后取上层清液至10 mL玻璃管中,在45 ℃用氮气浓缩仪吹干,准确加入500 μL初始流动相溶解残渣,过0.2 μm滤膜,待上机检测。

1.3 UHPLC-Q-TOF/MS条件

1.3.1色谱条件

色谱柱:安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);流动相:A相为5 mmol/L乙酸铵-0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为乙腈。梯度洗脱程序:0～1 min, 5%B; 1～6min, 5%B～15%B; 6～20 min, 15%B～30%B; 20～22 min, 30%B～90%B;然后保持3 min;之后由90%B降到5%B,保持5 min。流速:0.3 mL/min;柱温:40 ℃;进样量10 μL。

1.3.2质谱条件

离子源:电喷雾电离(ESI)源,正离子模式;干燥气温度:325 ℃;干燥气流速:10 L/min;雾化器压力:276 kPa;鞘流气温度:300 ℃;鞘流气流速:11 L/min;毛细管电压(capillary voltage): 4 000 V;扫描方式:正离子扫描,target MS/MS模式;TOF一级质谱和二级质谱扫描质量范围(m/z): 50～1 000;碎裂电压(FP): 100 V。

UHPLC-Q-TOF/MS配置了双喷雾器电喷雾源,可以连续导入参比溶液对仪器质量轴进行实时校正。选取m/z121.050 8和m/z922.009 7作为参比离子,对测定的目标物实时进行质量数校正,确保质量数误差小于5×10-6(5 ppm)。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

质谱条件中的碎裂电压和碰撞能量是影响离子丰度的重要条件,与方法的灵敏度密切相关。首先通过化合物结构式建立39种兽药的一级精确质量数据库,之后在ESI+模式下对单个分析物的标准品溶液进行全扫描,确定各化合物的母离子并优化碎裂电压(FP)。FP过低时不利于离子聚焦和传输,FP过高时会造成离子的源内裂解,两种情况都会对母离子响应造成影响。由于在TOF/MS扫描时质谱FP参数只能设置一个通用值,为兼顾各种化合物的响应以获得较高灵敏度,FP电压设为100 V。

以不同药物一级质谱获得精确质量数的分子离子峰进行二级质谱扫描,得到不同碰撞能量下各化合物的二级质谱图,然后通过仪器自带谱库编辑软件,建立39种兽药信息及二级谱图库。根据各化合物不同碰撞能下的二级谱图对比,选出合适的碰撞能量作为该药物筛查方法的二级碰撞能(见表1)。

表 1 39种兽药化合物的分子式、保留时间及碰撞能

2.2 色谱条件优化

流动相是影响化合物离子化的重要条件,影响色谱峰形和分离效果。实验比较了乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵-0.1%(v/v)甲酸水溶液3种流动相条件下色谱峰的分离及响应情况,发现在ESI+模式下,流动相中加入一定比例的甲酸有利于提高目标物的离子化效率,增大化合物的响应值。但孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫4种物质的色谱峰峰形及响应较差。而在流动相中再加入少量乙酸铵时,以上4种物质的出峰情况得到明显改善。为了尽量减少干扰、提高化合物响应并实现同分异构体的分离,实验最终采用乙腈-5 mmol/L乙酸铵-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相,以1.3.1节的梯度洗脱条件实现了39种化合物的分离检测,特别是对同分异构体磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶实现了有效分离测定(见图1), 39种化合物的保留时间见表1。

2.3 确定筛查检索标准

为保证筛查结果的准确性,实验基于化合物的保留时间、一级母离子精确质量数、同位素丰度比及二级质谱特征碎片谱图作为指标建立检索标准。采用target MS/MS扫描模式,一针进样同时获取一级、二级质谱数据。经优化,当一级筛查以±20×10-6(20 ppm)精确质量偏差提取化合物的分子离子峰,保留时间限定范围在±0.5 min,离子化形式选择+H、+NH4、+Na模式时,检索结果得分值≥70的化合物可初步确定为疑似阳性。之后对二级谱图进行检索确证,检索得分≥60的化合物被确证为目标药物。检索得分<60的化合物可通过背景扣除来降低杂质离子对检索的影响;如果仍不能达到得分要求,则需对比其主要碎片离子,若有两个及两个以上的主要碎片离子匹配,则可确证为目标药物。对加标样本进行测定,化合物锁定的保留时间误差范围均小于0.2 min,经参比溶液实时校准,所有化合物的质量数误差绝对值均小于5.0 ppm,满足欧盟的定性要求,方法实现了39种药物的无标准品、高选择性的快速筛查和确认。以三甲氧苄胺嘧啶为例进行说明,如图2所示,化合物经保留时间、一级母离子精确质量数、同位素丰度比比对,与三甲氧苄胺嘧啶的匹配得分为97.5,之后进入二级质谱图检索比对,与谱图库中三甲氧苄胺嘧啶二级质谱图的相似度得分为95.4,确证为三甲氧苄胺嘧啶。

图 1 39种兽药混合标准液的总离子流色谱图

图 2 三甲氧苄胺嘧啶的提取离子色谱图(EIC)、一级质谱图及二级碎片离子检索对比图

2.4 提取方法的优化

实验比较了乙腈、1%(v/v)甲酸乙腈、乙酸乙酯、甲醇作为提取溶剂时的提取效果。其中以乙酸乙酯、甲醇提取时,提取液浑浊,提取效率低;以乙腈作为提取试剂时,虽能够更有效地沉淀蛋白质,减少杂质干扰,但部分化合物提取回收率较低;而采用1%(v/v)甲酸乙腈提取时,39种兽药均取得了较好的提取效果,回收率均高于60%。因此实验最终采用1%(v/v)甲酸乙腈作为提取溶剂。为减少样品中脂类物质的干扰,实验在样品提取后采用冷冻离心法,将乙腈提取液于-4 ℃10 000 r/min冷冻离心20 min,吸取5 mL上清液进行下一步实验。

图 3 不同净化方式下兽药回收率分布图

图 4 不同净化方式下兽药基质效应分布图

2.5 净化条件的优化

本文分别考察了C18、PSA、EMR 3种吸附净化剂的效果。C18可吸附样品中的脂肪和蛋白质,PSA可吸附样品中的脂肪酸和糖类杂质,但实验发现在20 μg/kg添加水平下,C18、PSA的净化效果不理想,对部分药物均有不同程度的吸附,分别有7种和14种目标物的回收率低于70%(见图3)。EMR具有疏水选择性和吸附作用,对含有直链烃结构的脂类等大分子物质去除率较高,当采用EMR处理时,仅有3种药物的回收率低于70%,质谱图中的杂质峰相对其他两种吸附剂明显减少。按照基质效应(ME)=(1-基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)×100%计算目标兽药的基质效应,3种方式净化后的基质效应分布见图4。结果表明,采用EMR吸附净化手段,基质效应明显降低,最终选取EMR作为净化分散剂。实验通过比较不同用量(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g)分散剂的吸附净化效果,发现随着EMR的使用量从0.4 g增加到1.0 g, 39种兽药的平均回收率由72.6%上升到82.3%,平均基质效应(基质效应取绝对值后平均)由35.9%降低到25.7%,但增加到1.2 g时平均回收率为80.6%,略有降低。实验最终选取净化分散剂EMR的量为1.0 g。

NaCl可使样品中的水分充分析出,从而有利于吸水剂的吸附。无水MgSO4吸水容量大,能明显减少水相,从而促进兽药在有机相中的分配和两相的分层,在提取步骤中,MgSO4水合作用是一个强放热过程,可使提取液变热,有利于提高提取效率[24]。实验选取NaCl和无水MgSO4分别作为盐析剂和脱水剂。另外为减少色素等其他基质的干扰,实验分别对加入5、10、20、30、40、50 mg石墨化多壁碳纳米管的净化效果进行了考察,发现当石墨化多壁碳纳米管用量从5 mg增至30 mg时,净化后的溶液能够更澄清、干净,杂质干扰峰减少。但当石墨化多壁碳纳米管用量增至40 mg时,大部分兽药的提取回收率开始出现下降,说明吸附剂过多会导致目标物的吸附、损失(见图5)。实验最终选择加入30 mg石墨化多壁碳纳米管为净化吸附剂。

图 5 不同用量石墨化多壁碳纳米管下39种兽药的平均回收率

2.6 方法的线性关系、定量限、回收率和精密度

根据目标化合物在质谱中的响应,以空白样品提取液配制不同浓度的混合标准系列,在选定的色谱和质谱条件下进行测定,以标准品的质量浓度为横坐标,以相应组分的响应值为纵坐标,结果显示39种兽药的标准曲线线性关系良好,线性相关系数(r2)均在0.99以上。以不同添加水平下空白基质的仪器响应为基准,分别以3倍信噪比和10倍信噪比考察了方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 39种兽药的LOQ为3～15 μg/kg(见表2)。

表 2 39种兽药的线性回归方程、r2、线性范围、检出限及定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 3 39种兽药的回收率及相对标准偏差(n=6)

图 6 阳性样品的EIC图

为了评估方法的准确性,在LOQ、2LOQ及4LOQ 3个添加水平下进行加标回收率试验,每个水平做6个平行样品,39种兽药的回收率及RSD见表3,结果表明方法能够满足实际检测的要求。

2.7 实际样本检测

在最佳实验条件下对20个克氏螯虾样品中的兽药残留进行筛查,其中1份克氏螯虾样品检出禁用药物孔雀石绿,一级筛查得分90.3,二级确证得分75.4,含量为4.63 μg/kg; 1份克氏螯虾检出恩诺沙星,一级筛查得分96.5,二级确证得分92.1,含量为15.82 μg/kg,未超出我国限量标准(见图6);剩余样品均未检出这39种兽药残留。为了验证检测结果,实验室参照国家标准[25,26],采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱法对上述检出的阳性样品进行了对比测试,分别测得孔雀石绿含量平均值为5.01 μg/kg，恩诺沙星含量平均值为16.26 μg/kg，经t检验法分析，p值均大于0.05，两种方法所测结果无显著性差异。

3 结论

本工作建立了克氏螯虾中喹诺酮类、磺胺类、三苯甲烷类共39种兽药的快速筛查方法。样品经酸化乙腈提取,EMR-Lipid结合石墨化多壁碳纳米管净化,UHPLC-Q-TOF-MS一针进样,同时进行一级初筛及二级确证,方法简便、快速、准确,可有效避免假阳性结果的出现,为克氏螯虾中39种兽药残留的快速筛查和确证提供了技术支持,同时也可以为其他水产品中多兽药残留的筛查提供方法参考。