2种地衣共生蓝藻的分离鉴定及其形成藻结皮条件的研究

古海尼沙·买买提，吉米拉木·加马力， 帕孜来提·拜合提

(新疆大学 生命科学与技术学院, 乌鲁木齐 830046)

随着自然资源的开发利用，土地荒漠化和环境质量恶化已成为人类共同面临的问题，利用现代科学技术改造沙漠，防沙治沙，保护生态环境，实现可持续发展是最重要的任务[1-3]。干旱荒漠地区形成的藻结皮保留水分，不仅有效地阻挡了流沙的运动，也为高等植物生长创造了生存环境。当沙面形成结皮时，表面粗糙度增加，风阻力显著提高，从而降低了流沙，渐趋稳定，达到固沙治沙的目的[4-6]。藻类的分泌物和胞外多糖使藻丝体与沙粒缠绕在一起，形成一层致密的防腐蚀层，提高沙土表面的稳定性和抗风蚀能力[7]。

具鞘微鞘藻是荒漠干旱地区的代表性藻类物种，适应在严重缺水、营养缺乏、沙层流失等极端环境中生长繁殖，通过藻丝体把松散的沙土粘在一起提高沙土的团聚力，对藻结皮的形成发育过程有重要的意义[8-10]。普通念珠藻在提高沙土结构的稳定性及沙土肥力，保持水土，防止风蚀，固定流沙等方面也起到了一定作用[11]。

菌藻共生的特殊生物——地衣中的共生藻类(photobiont)，虽然仅占地衣体的10%，通过光合作用为占地衣体90%的地衣共生菌(mycobiont)制造碳水化合物，在地衣型真菌的生存以及地衣生物整体结构的构建中起着不可忽视的重要作用[12-14]。为了深入了解地衣共生藻的种类、生物特性和应用价值，本研究以地卷中分离的2种共生藻为研究材料，对藻结皮形成条件进行研究，该研究在地衣体内藻类资源的挖掘和开发利用中具有一定的参考价值。

1 材料和方法

1.1 材 料

以储存于试验室-20 ℃冰箱内的2种地卷属地衣即地卷(Peltigerarufescens)和平盘软地卷(P.elisabethae)为研究材料，采集于新疆乌鲁木齐市南山八一林场，海拔高度为1 766～2 200 m，进行了共生藻的分离培养。

1.2 地衣共生藻的分离培养

称取适量的地衣体并切成小块，自来水冲洗约1 h，75%乙醇处理5 min，无菌水清洗3遍，在无菌条件下放入研钵中充分研磨 (10 min)。把匀浆液涂布在已制备好的BGII[15]固体培养基中。定期观察地衣共生藻的生长情况，划线法转接培养进行纯化并在显微镜下观察形态特征，描述并拍照。

1.3 地衣共生藻的分子鉴定

分离培养获得的地衣共生藻DNA用上海生工DNA提取试剂盒(EZ-10 Spin Column Genomic DNA Isolation Kit BS423)提取，rDNA-ITS序列的扩增引物为蓝藻ITS1(5′-TGTACACACCGACC-GTC-3′)和ITS2(5′-CTCTGTGCCTAGGTATCC-3′)，测序结果NCBI数据库Blast比对分析， Mega 7软件ML法构建系统发育树[16]。

1.4 形成人工藻结皮条件的研究

1.4.1人工藻结皮的培养先把处理后的土样平铺(厚度<1)在烘箱中，温度调为95 ℃，烘5 h，再将灭菌后的土样冷却并分装在16 cm×10 cm的塑料盒中。在无菌条件下准备的2种藻种[I1b具鞘微鞘藻(Microcoleusvaginatus)和 L2念珠藻(Nostocsp.)]分别均匀地喷洒在土样表面，另外将具鞘微鞘藻和念珠藻的藻培养物以不同的比例充分混匀(按鲜重计)后喷洒在土样表面。将接种后的塑料盒置于光照培养架[(25±5) ℃，1 000～2 000 Lx，光周期12 h/12 h]上进行人工藻结皮培养。每天早上9:00把每个接种过的处理组放在电子天平上称重，并用少量微喷补足方法来浇水。每隔7 d补充1次BGⅡ营养液(方法跟补水法一致)，补营养液的当天不要加水。

1.4.2人工藻结皮试验条件的设置本研究以沙土含水量、接种量(以叶绿素a含量计)和混合藻比例为主要因子，研究其对人工藻结皮形成的影响。其中，沙土含水量设置5个水平，分别是0%(CK)、5%、10%、15%和20%；接种量也设置5个水平，分别是0(CK)、5、10、15和20 μg/cm2；混合藻类构成比例(具鞘微鞘藻：念珠藻)设置3个水平，分别是1∶1(CK)、1∶3和3∶1。在处理每一个因子时，其他因子均固定，每一个因子重复3次。

1.4.3藻结皮生物量的测定分别于试验第0、5、10、15、20、25、30天，收集结皮块4 cm2，去除底层沙粒, 放入10 mL离心管中，加入5 mL 95%乙醇并振荡，置于黑暗处室温下过夜，8 000 r/min离心机上离心5 min，取上层清液，分别测定吸光度值OD665和OD649，最后计算出 1 cm2的结皮块样本所包含的叶绿素a含量，即视为藻结皮生物量，公式如下：叶绿素a含量=5/4(13.95OD665-6.8OD649)[17]。

1.4.4藻结皮超微结构的观察人工藻结皮显微结构用Motic 400 L 数码体式显微镜对观察，并拍照。应用S-570 型扫描电子显微镜观察藻结皮的超微结构，并照相。

1.5 数据处理

试验数据的统计分析采用SPSS 22.0软件完成，利用Duncan方法进行差异显著性的比较。并用Excel 2010来计算数据和制作图形。

2 结果与分析

2.1 分离培养地衣共生藻的形态鉴定

从平盘软地卷中分离得到共生藻I1b，从地卷中分离得到共生藻L2，二者的形态特征均类似原核生物蓝藻(图1)。其中，藻株I1b为多细胞，丝状体，集聚成群，通常不分枝，不具有异形胞，藻丝有鞘[18]，主要形态特征与颤藻科(Oscillatoriaceae)微鞘藻属(Microcolus)具鞘微鞘藻相一致(图1，A)。而藻珠L2的藻丝为较深的绿色，无真分枝或伪分枝，具有异形胞，藻丝念珠状，幼体球形，成熟后扩展为扁平或波状片体有时边缘呈不规则撕裂状，有的有穿孔。主要形态特征与念珠藻科(Nostocaceae)念珠藻属(Nostoc)的种类较为相近(图1，B)。

2.2 地衣共生藻的分子鉴定

2种藻ITS 序列的Blast比对结果显示I1b与具鞘微鞘藻, L2与念珠藻属均具有97%的相似度。

A. I1b ；B. L2图1 分离培养的共生藻的显微结构 (10×40)Fig.1 Microscopic structures of lichen photobionts (10×40)

用Mega 7软件 ML法构建的系统发育树分析结果可见，I1b以100%支持率与具鞘微鞘藻聚类在一个分支，说明其亲缘关系很近；L2与念珠藻属聚类在一个分支，支持率为93%(图2)。

2.3 沙土含水量对2种藻的人工藻结皮中生物量的影响

2.3.1具鞘微鞘藻生物量随着沙土含水率的增加和时间的延长，人工藻结皮中具鞘微鞘藻的生物量不断增加积累。接种第10天后，不同的沙土水分处理组开始形成肉眼能看到的藻类结皮；第20天后，具鞘微鞘藻结皮层厚度大量增加，及其生物量水平逐渐趋于稳定。

方差检验结果表明，不同沙土含水量对具鞘微鞘藻生物量的影响极显著(F=11.226，P<0.01)。接种后第15天CK处理组发现藻类生物量的最小值0.646 μg/cm2，第25天15% 处理组中(图3)出现最大值(11.34 μg/cm2)。10%、15%和20%处理组，藻类生物量显著高于5%与0%(CK)处理组。沙土含水量为15%时，藻类的生物量大，但沙土含水量20%时藻生物量未继续增加，反而略有下降，说明过量的沙土水分含量不一定有利于藻结皮中藻类的生长 (表1)。可见，人工藻结皮形成过程中，具鞘微鞘藻生物量与沙土含水量(0%～15%)呈正相关，而且沙土含水量15%时具鞘微鞘藻的生物量显著增高，考虑到沙漠地区的供水不足，沙土含水量10%时也可形成较理想的藻结皮层。

表1 不同沙土含水量下具鞘微鞘藻和念珠藻平均生物量的变化

图2 分离培养蓝藻类藻种的 rDNA-ITS序列的ML 进化树Fig.2 The ML evolution tree of rDNA-ITS sequence of lichen photobionts

初始接种量为5 μg/cm2；藻生物量用叶绿素a含量表示；不同小写字母表示同一时间不同处理间差异显著(P≤0.05)。图4同图3 不同沙土含水量下具鞘微鞘藻生物量的变化The initial amount of inoculation is 5 μg/cm2；Algal biomass is expressed by chlorophyll a content；Different letters mean the significant difference between treatments at the level of 0.05. The same as Fig.4Fig.3 The biomass of M. vaginatus under different soil water content

图4 不同沙土含水量下念珠藻生物量的变化Fig.4 The biomass of Nostoc sp. under different soil water content

2.3.2念珠藻生物量藻接种第20天后，10%、15%、20%的处理组可见藻结皮形成，第20天后，念珠藻的厚度显著增加，生物量总体水平逐渐稳定。方差检验结果表明，(F=3.675，P<0.05)不同沙土含水量对念珠藻的藻结皮生物量影响显著(图4)。接种第15天的CK(0%)处理组中发现藻类生物量的最小值为0.089 μg/cm2，最大值(2.849 μg/cm2)出现在第20天的20%处理组(图4)。15%和20%处理组的藻类生物量大于CK(0%)、5%和10%处理组(表1)。20%、15%处理组间无明显显著差异，20%与5%、0%(CK)处理组间有显著差异。结果表明，念珠藻藻结皮形成，沙土含水量的增加对藻类生物量起着重要的作用。随着含水量的增加生物量也增加，沙漠地区的供水不足条件下，10%沙土含水量条件下，也可产生较理想的藻结皮。

2.4 接种量对2种藻的人工藻结皮中生物量的影响

2.4.1接种量对具鞘微鞘藻生物量的影响具鞘微鞘藻接种量与形成的藻结皮中藻类的生物量呈现明显的正相关性(图5)。生物量的快速增加趋势可以从接种后的第5天开始明显，可观察到第一个高峰，10、15和20 μg/cm2的处理组形成可见的藻结皮；第二次高峰值出现在接种后第15天，而且藻结皮厚度明显增加。随着培养时间的延长藻类整体生物量水平逐渐稳定，但接种后30 d 生物结皮中藻类的生物量开始下降。

方差检验结果表明，不同接种量对藻结皮生物量的影响显出极显著(F=13.903，P<0.01)。由表2可知，0(CK)与5、10、15、20 μg/cm2处理组之间有显著差异；处理组5 μg/cm2与15、20 μg/cm2之间也存在差异；藻结皮生物量的大小可以排到20>15>10>5>0(CK)μg/cm2。藻类生物量最大值(10.941 μg/cm2)出现在接种后第20天的接种量为20 μg/cm2处理组，最小值(0.332 μg/cm2)出现在接种后第5天的接种量为0(CK)处理组(图5)。这表明，随着具鞘微鞘藻的藻类接种量的增加其生物量也增加。15和20 μg/cm2处理下的生物量平均值接近于最早的初始接种量，因此10 μg/cm2接种量选择为最佳接种量。

2.4.2接种量对念珠藻藻生物量的影响结果可知，随着时间的推移念珠藻的接种量增加其生物量也越来越增加，表现出上升趋势(图6)。接种第5天后，念珠藻的生物量迅速增加达到第一个高峰，第20天达到第二个高峰值，逐渐趋于稳定，第30天后藻类生物量开始下降。

方差检验结果表明，不同接种量处理的念珠藻生物量的影响极显著(F=9.377,P< 0.01)。由表2可知:0(CK)与5、10、15、20 μg/cm2处理间均有显著差异，5、10(μg/cm2)与15、20(μg/cm2)处理间也存在显著差异。5和10(μg/cm2)之间无显著差异。各处理组的念珠藻生物量的大小为20>15>

10>5>0(CK) μg/cm2。念珠藻生物量最大值(5.091 μg/cm2)出现在接种后第20天的接种量为20 μg/cm2处理组，最小值(0.121 μg/cm2)出现在接种后第5天的0(CK)μg/cm2处理组(图6)。综上所述，念珠藻接种量的增加使人工结皮中藻生物量增加。20 μg/cm2处理下念珠藻生物量最高，但考虑到荒漠的实际情况，所以10 μg/cm2被认为是较合适的接种量。

表2 不同接种量下具鞘微鞘藻和念珠藻平均生物量的变化

沙土含水量为10%，不同字母表示不同的处理间在0.05水平差异显著。图6同图5 不同接种量下具鞘微鞘藻生物量的变化The soil water content is 10%; different letters indicate significant difference at 0.05 level between treatments. The same as Fig.6Fig.5 The biomass of M. vaginatus under different inoculation amounts

图6 不同接种量下念珠藻生物量的变化Fig.6 The biomass of Nostoc sp. under different inoculation amounts

沙土含水量为10%；1∶1、1∶3、3∶1分别表示具鞘微鞘藻∶念珠藻的混合比例；人工藻结皮中生物量用叶绿素a含量表示；不同字母表示同一时间不同处理间差异显著(α=0.05)。下同图7 不同比例混合藻种对人工藻结皮中生物量的影响The soil water content is 10%；1∶1, 1∶3 and 3∶1 indicate the mixing ratio of Microcystis vaginatus∶ Nostoc sp., respectively; the biomass of artificial algae crust is expressed by chlorophyll a content； different letters indicate significant difference at 0.05 level between treatments. The same as belowFig.7 Effect of different proportions of two mixed species on biomass in artificial algal crust

2.4.32种混合藻种不同比例构成对人工藻结皮中生物量的影响不同比例的具鞘微鞘藻与念珠藻混合藻接种量对藻结皮中藻类生物量产生不同的影响(图7)。具鞘微鞘藻和念珠藻比例为3∶1处理组接种后第25天，结皮中藻生物量达到最大；1∶1处理组的藻类生物量接种第10天后逐渐增加，也是第25天达到了最大值；1∶3处理组中生物量增加不明显。检验结果表明，混合藻比例构成藻结皮的藻类生物量有显著的差异(F=8.288，P<0.05)。利用不同比例的混合藻形成藻结皮时，藻生物量的最大值(11.917 μg/cm2)出现在接种后第25天的3∶1处理组。最小值(1.638 μg/cm2)出现在接种后第10天的1∶3处理组。由表3可知，3∶1处理组与1∶1、1∶3处理组的藻类生物量有显著差异(图7)。1∶1处理组与1∶3处理组生物量也有显著差异。各处理组的藻类生物量大小依次为藻混合比列3∶1>1∶1>1∶3。这说明，一定比例的具鞘微鞘藻对藻类生物量的增加有显著影响。

2.5 人工藻结皮超微结构的观察

扫描电镜观察藻结皮的超微结构结果(图8)显示，培养时间达20 d 时，沙土含水量和2种藻混合比例等因素对形成的藻结皮中藻类的形态结构存在一定的影响。2种藻分别用不同沙土含水量处理时，CK组在裸沙中基本上为松散的沙粒，很少发现丝状藻类(图8，a和c)，随着浇水量的增加结皮中藻丝明显发达，能更好地把沙粒缠绕在一起，藻丝同时分泌大量的胞外多糖(图8，b和d)。2种藻分别用不同藻接种量处理时，CK组无结皮形成，沙粒表面的微形态排列松散，根本观察不到丝状藻类的出现(图8，e和g)；当达到合适的接种量时，沙粒可逐渐发育成藻结皮, 丝状藻类明显增多，能把更多的沙粒缠绕一起，而且可以看出藻结皮有固定沙粒的效果(图8, f和h)。混合构成藻比例(3∶1)的处理组中看出来，与单一种藻类构成的藻结皮相比，2种混合藻的藻结皮更多，混合藻种比单一藻种更容易形成荒漠藻结皮(图8, i和j)。

表3 混合藻种不同比例构成对人工藻结皮中平均生物量的影响

3 讨 论

地衣是菌藻共生并经过漫长的生物演化形成的，具有高度遗传稳定性的特殊生物。目前地衣学家公认地衣并非是低等植物，地衣的学名、分类地位、外部形态均由共生菌决定，因此地衣的系统学本质应归属于真菌。但Vernon Ahmadjian 等研究指出，通过光合作用为地衣型真菌的生存提供所需营养物质的共生藻，虽然仅占地衣体的10%，但可能具有与共生菌同等重要的生理功能[19]，因此地衣共生藻物种多样性及其与地衣共生菌的互惠共生，协同进化机制的研究成为了国外地衣学家关注的研究热点之一[20-25]。

a～d.不同沙土含水量藻结皮超微结构:a、c.藻I1b和L2的对照组，b、d.沙土含水量为20%时，藻I1 b和L2的发达藻丝体胞外分泌物对沙粒的粘结、束缚作用最明显；e～h.不同藻接种量藻结皮超微结构:e、g.藻I1b和L2的对照组， f、h.藻I1b和藻L2的最佳条件即10 μg/cm2；i、j. 2种混合藻比例下藻结皮超微结构:i.I1b: L2为1∶3, j.I1b: L2为3∶1图8 藻结皮样品超微结构a-d. Represent the effects of soil water contents to the ultrastructure of crust: a and c.Control of I1b and L2; b and d.Sandy soil particles were sticked together by lots of I1b and L2 algal filaments and their secretory products under 20% soil water content; e-h. Represent the effects of different algae inoculum doses to the ultrastructures of crust: e and g.Control of algae I1b and L2; f and h. Optimal conditions for algae I1b and L2 respectively, that is 10 μg/cm2; i and j. Represent the effects of mixed algae ratio to the ultrastructure of crust: i. I1b: L2 is 1∶3; j. I1b: L2 is 3∶1Fig.8 Microstructures of various algal crust samples

具鞘微鞘藻和念珠藻是地衣共生体中较为重要的2类蓝藻。蓝藻是生物结皮中的先锋生物，具鞘微鞘藻是荒漠藻结皮最主要的优势物种，在藻结皮的形成和发育过程中发挥着非常重要的作用[26-27]。念珠藻是人体蛋白的极好来源，也能产生许多珍稀天然活性物质，在医药、食品、水产养殖、农业和环保等领域具有重要的开发价值。

水分的极度短缺，营养不足是干旱、半干旱地区最为显著的生态特征。水分对沙漠生物的生长中起重要作用[28]。当裸沙表面藻类生物量达到一定水平时，可以形成可见的藻结皮，随着接种量的增加藻类生物量的积累也随之增加。研究结果表明，在一般条件下裸沙表面不产生藻结皮，生物量也很低。当沙土含水量低于5% 时，不仅不能有效地形成藻结皮，而且原有结皮厚度也不再增加。在干旱期间，具鞘微鞘藻和念珠藻对外界环境不表达生理活动，只有沙土含水率达到一定程度时，可以为2种藻类提供湿润环境，能够维持藻丝的正常生理活动，相应地能提高其生物量。研究结果表明，在一般条件下裸沙表面不产生藻结皮，生物量也很低；当2种藻类的沙土含水率高于10% 时，生物量也增加，与黄文福等[29-30]的研究相一致。沙土所含水分的增加也能增高藻类的生物量。郑云普等[31]研究指出，藻初始接种量的增加可以促进生物结皮中生物量的积累，但量超过了一定值的时候生物结皮中藻类生物量不一定继续增加。

因为随着藻量和密度的增加，光源之间出现相互屏障，就无法照射到细胞，对光合作用有利的光强就减弱会导致藻类生物量的增殖率下降。早期裸沙表面由于营养不良，未能提供2种藻类所需补充的营养，可能导致部分藻丝体的衰亡抑制生物量的增加，后面藻类生物量也越来越稳定。2种混合藻构成的藻结皮生物量的影响中，具备了一定比例的2种藻之间有互惠互利作用。具鞘微鞘藻的量达到一定程度的时候，促进藻结皮的快速形成和生物量的增加。与沙土含水量，接种量对单一藻种的藻结皮生物量的影响相比，2种混合藻种的藻结皮生物量的影响更明显。

从本研究结果可以看出，具鞘微鞘藻比念珠藻在适应荒漠环境、产生更多藻丝、快速形成藻结皮、提高沙土表面颗粒团聚力等方面较强。具鞘微鞘藻对沙粒有更高的藻束缚作用，捆绑流动沙粒形成致密层等特征占了主导地位[32]。本研究中固定其他因子的条件下，构成混合藻比例随着具鞘微鞘藻量的增加藻结皮的生物量也增加。混合藻比例中3∶1也就是具鞘微鞘藻量多的试验组生物量显出最高趋势。适量的念珠藻也能对藻结皮的形成以及藻类生物量的增高有利。

4 结 论

本研究通过形态鉴定，基于ITS基因序列比对及构建的ML系统发育树，分析确定了分离于2种地卷的2株地衣共生藻的分类地位均属于蓝藻门，其中分离自平盘软地卷的地衣共生蓝藻属于微鞘藻属，分离自地卷的共生藻属于念珠藻属。具鞘微鞘藻和念珠藻在试验室模拟的荒漠极端环境中形成人工结皮的最适合的沙土含水量为10%，接种量为10 μg/cm2。2种藻混合接种的最适比例为3∶1(具鞘微鞘藻：念珠藻)。