玉米ZmNPR1基因的克隆及表达分析

王新涛，杨 青，代资举，郝俊杰，王 艳，张莹莹，李保全*

(1 河南省农业科学院 作物设计中心, 郑州 450002；2 河南省农业科学院 植物保护研究所, 郑州 450002)

植物在应对病原菌侵害时形成一系列的防御机制，其中水杨酸诱发的系统获得抗性(systemic acquired resistance, SAR)以及茉莉酸和乙烯介导的诱导性系统抗性(induced systemic resistance, ISR)能有效抑制病原物对植物体的侵害[1-2]。研究表明，NPR1(nonexpressor of pathogenesis-related genes 1)是连接这2种抗病机制的核心调控基因[3-5]。

自1994年从拟南芥中分离得到NPR1基因以来，研究人员对该基因的结构组成、抗病抗逆的作用机理以及转基因抗病育种等方面做了较为系统的研究。NPR1蛋白在N端包含一个BTB/ POZ家族结构域，中间区域包含一个锚蛋白重复结构域ANK以及C端的NPR1保守结构域，这些结构域在蛋白与蛋白之间的互作中起着重要作用[6-8]；在细胞质中NPR1蛋白通常以二硫键的形式结合形成多聚体, 受到病原菌侵袭时NPR1单体开始释放并进入细胞核，在核内与TGA等转录因子结合,激活相关防卫基因的表达，最终引起防御反应[9-10]；目前，烟草、小麦、水稻、棉花、梨、大豆、油菜等植物中的NPR1基因已经被克隆，其中在拟南芥中过表达AtNPR1基因可以增强对霜霉菌的抗性，在水稻中过表达OsNPR1基因能够明显提高对白叶枯病的抗性，在小麦中过量表达AtNPR1 增加了对赤霉病菌的抗性，这些转基因研究结果表明NPR1介导的抗性途径可能是保守的途径[11-15]；同时NPR1本身没有抑菌活性且对病原菌没有严格的种属专一性，它主要是诱发下游基因的多种防卫反应，使植物体内产生广谱抗性[16]。

玉米粗缩病(maize rough dwarf disease, MRDD)是黄淮地区玉米主产区的主要病害，携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱是其主要传播途径[17-18]。迄今尚未发现对粗缩病完全免疫的材料，少量的高抗材料主要来自美国杂交种78599 选系，其遗传基础较窄[19-20]。NPR1基因作为调控植物抗病反应的关键因子，在植物水平抗性中起着重要作用，目前还未见玉米NPR1在粗缩病抗性方面的研究报道。本研究以玉米粗缩病高抗自交系D863F为供试材料，克隆了玉米ZmNPR1基因全长序列，对该基因的生物信息学特征进行分析，采用荧光定量PCR技术研究该基因在水稻黑条矮缩病毒侵染后不同阶段的动态表达，检测了其在玉米不同部位的表达差异，对于揭示玉米ZmNPR1与粗缩病的相互作用并探讨其抗病机制具有十分重要的意义。

1 材料和方法

1.1 材 料

以玉米高抗粗缩病自交系D863F为材料[21]，供试材料种植行长2 m，行距0.6 m，每行10株，株距0.25 m。2017年4月在河南省农业科学院原阳试验基地种植，播种后加盖防虫网，幼苗长至3片叶时放入带毒灰飞虱(携带水稻黑条矮缩病毒，Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)进行接种处理。取放虫后0、24和72 h的叶片；在玉米散粉吐丝期取叶片、茎、根、雄穗、雌穗以及花丝等不同部位，所有样品经液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用，每个样品3个生物学重复。

1.2 方 法

1.2.1玉米DNA和RNA提取及cDNA第一链合成采用CTAB法提取玉米叶片DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，样品保存在-20 ℃冰箱备用。利用TRIzol法提取样品总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，RNA样品保存在-80 ℃冰箱备用。使用PrimeScript RT-PCR Kit(TaKaRa)试剂盒，以不同玉米材料总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。

1.2.2玉米ZmNPR1基因的克隆根据NCBI GenBank中玉米NPR1 基因的mRNA序列(NM_001154115)，利用Primer Premier 5.0软件设计用于扩增ZmNPR1全长引物：ZmNPR1-F(CCCTCACCTTATTCCCTGTAGC)和ZmNPR1-R(CCT-GCCATGTTTCCTTATGTTC)。以D863F 基因组DNA和反转录cDNA为模板进行全长扩增。PCR反应体系为25 μL，DNA/cDNA模板 1 μL、10×PCR buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP mix 1 μL、上下游引物各 1 μL、LaTaq酶 0.3 μL、ddH2O 18.7 μL。PCR程序：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 3 min，35个循环，最后72 ℃继续延伸 10 min。将扩增片段回收后连接至pMD18-T载体，在上海生工进行测序。

1.2.3ZmNPR1的生物信息学分析利用NCBI的ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)、CCD(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/ docs/cdd_search.html)工具预测基因ORF和进行蛋白序列保守结构域分析；使用ExPAsy的Compute pI/MW(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)工具计算蛋白质的分子量及等电点；利用 cNLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/)预测核定位信号；利用DNAMAN8软件进行蛋白序列比对。

1.2.4ZmNPR1实时荧光定量PCR表达分析根据已克隆的ZmNPR1 cDNA序列设计荧光定量引物DF1(GCTGCCGAAACCGCTTGA)和 DR1(CGACGCGAACGTGATGGAC)，以叶片、茎、根、雄穗、雌穗和花丝作为不同组织材料进行取样；以侵染后不同时期的叶片为材料取样，未侵染植株叶片为对照；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参基因，设计引物为DF2(CCATCACTGCCACACAGAAAAC)和DR2(AGGAACACGGAAGGACATACCAG)。反应体系为15 μL，其中SYBR Premix ExTaq(TaKaRa) 7.5 μL、上下游引物各0.6 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 5.3 μL。定量PCR程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，54 ℃退火30 s，40个循环，最后进行熔解曲线分析，用 Bio-Rad Miniopticon Real-Time PCR仪扩增。数据釆用2-ΔΔCT算法进行基因的相对表达量分析。

2 结果与分析

2.1 玉米ZmNPR1基因的克隆

分别以玉米自交系D863F的cDNA和gDNA为模板，克隆得到玉米ZmNPR1基因(GenBank登录号为MH619241)的cDNA和gDNA序列(图1)。其中cDNA全长2 442 bp，包含一个1 866 bp完整开放阅读框，编码621个氨基酸， 5′端非编码区423 bp， 3′端非编码区153 bp。ZmNPR1的gDNA序列全长3 727 bp，通过MaizeGDB数据库分析发现，该基因位于玉米第8染色体的8.09区段。利用DNAMAN8对ZmNPR1的cDNA和gDNA序列进行比对，结果表明ZmNPR1基因包含4个外显子和3个内含子。

2.2 ZmNPR1基因的生物信息学分析

经预测ZmNPR1基因ORF编码的蛋白分子量为67.61 kD，等电点为5.46。利用 cNLS Mapper预测在C端有一段核定位信号(图3)。NCBI的CCD分析保守结构域发现蛋白N端具有BTB保守结构域，中间部分包含一个锚蛋白重复结构域ANK， C端有一段NPR1保守结构域(图2)。

2.3 ZmNPR1同源及进化分析

从NCBI数据库查找到14种植物的NPR1蛋白序列，采用邻接法(neighbor-joining)与玉米ZmNPR1蛋白序列对比并建立了一个无根分子系统进化树(图4)。系统进化分析将15个不同植物的NPR1蛋白划分为2组，其中ZmNPR1与小麦、大麦、高粱、水稻、百合、香蕉、大豆、沙梨和烟草的NPR1蛋白聚为一类，且与高粱的相似性最高，达到97%。

2.4 水稻黑条矮缩病毒诱导的表达分析

qRT-PCR分析表明，在带毒灰飞虱未侵染D863F时，ZmNPR1表达量较低；在侵染1 d后，抗性材料D863F中ZmNPR1基因被迅速诱导；随着侵染时间的增加，ZmNPR1的表达量持续上升，在侵染后第3天表达量约为未侵染时的2.87 倍，而ZmNPR1在对照组中的表达变化较小且表达量较低(图5)。

2.5 不同部位的组织特异性表达分析

组织特异性实时荧光定量分析表明：ZmNPR1在不同器官中均有表达，在雌穗中的表达量最高，雄穗中的表达量最低，其中在雌穗中的表达量约为雄穗中的8.78倍，叶片、花丝、茎、根中的表达量次之(图6)。

M. DNA marker 10 000 bp；1. cDNA；2. gDNA图1 ZmNPR1基因 PCR 扩增Fig.1 The PCR amplified product of ZmNPR1 gene

图2 ZmNPR1蛋白功能性位点分析Fig.2 Conserved domain analysis of ZmNPR1 protein

下划线部分为核定位信号图3 ZmNPR1基因开放阅读框及预测氨基酸序列The nuclear localization signal is underlinedFig.3 ORF of ZmNPR1 gene and the corresponding amino acid sequence

图4 不同物种间NPR1蛋白的进化树Fig.4 Phylogenetic tree of NPR1 protein homologues from different species

不同小写字母代表0.05水平差异显著图5 ZmNPR1在病毒侵染后不同时期的表达Different normal letters represent significant difference at 0.05 levelFig.5 The expression pattern of ZmNPR1 in different periods after RBSDV induction

不同小写字母代表0.05水平差异显著图6 ZmNPR1在不同组织的表达Different normal letters represent significant difference at 0.05 levelFig.6 Relative abundance of the ZmNPR1 transcripts in different maize tissues

3 讨 论

玉米粗缩病在中国玉米主产区黄淮海地区有不同程度的发生，造成部分地区玉米减产甚至绝收，严重影响玉米生产的稳定性，因此培育抗粗缩病品种是当前玉米育种的主要目标之一[18]。研究表明NPR1基因参与植物SAR 和ISR 的建立，对于植物产生广谱抗性至关重要[22-23]。基于NPR1在植物抗病过程中的重要作用，分析玉米ZmNPR1基因的结构组成及在水稻黑条矮缩病毒诱导下的表达情况对阐明玉米抗粗缩病机制具有重要意义。

研究发现，在受到外源物质信号诱导后，拟南芥NPR1 蛋白和其他蛋白质在核内选择性的互作进而激活相关SAR基因[7, 24]。本研究从高抗粗缩病玉米自交系中克隆得到ZmNPR1基因，并对其进行了初步的生物信息学分析。玉米ZmNPR1蛋白与其他已报道的NPR1类基因的蛋白保守结构域具有很高的相似性，在其N端和中间具有NPR1家族典型的BTB和ANK保守结构域，C端预测有核定位信号，玉米ZmNPR1蛋白可能在细胞核中通过保守结构域与其他下游蛋白产生互作，并诱导产生多种抗病反应。系统进化树分析显示，同为禾本科的玉米、高粱、水稻、小麦、大麦之间NPR1蛋白的相似性较高，与拟南芥NPR1蛋白的相似性只有41%，暗示了玉米ZmNPR1基因在进化过程中除了保留NPR1类基因的基本功能外，可能还具有新的作用机制，需要进一步深入研究。

在水稻中过量表达NPR1 能明显提高其对水稻白叶枯病菌的抗性，接种赤霉菌后小麦TaNPR1能迅速响应赤霉菌的诱导而上调表达，表明NPR1类基因在单子叶植物中对多种病害的抗性起重要作用[12-13]。本研究结果还表明，水稻黑条矮缩病毒侵染玉米后ZmNPR1基因能够快速上调表达，并且后期在不同部位也检测到该基因的组成型表达，推测ZmNPR1基因在玉米抵抗水稻黑条矮缩病毒中扮演关键的角色，在玉米的生长发育过程中起着重要作用。相关QTL定位发现玉米粗缩病受多个数量性状基因调控，致病机理复杂，目前还没有克隆到目标抗性基因[20]。本研究中玉米ZmNPR1 基因cDNA和gDNA的获得及病毒诱导后的表达模式为深入进行玉米粗缩病抗病机制研究奠定了基础。