APPL1在肺癌组织中的的表达及其与EGFR的关系＊

朱赞雷 ，陈碧嬛 ，王建 ，张敏 ，乐永宏 ，赖庆文

(江西省赣州市人民医院，1、呼吸科；2、心内科；3、病理科；4赣南医学院第一附属医院呼吸科，赣州 341000)

肺癌是人类健康最具有威胁的杀手之一。在我国，肺癌的发病率、死亡率已经成为所有恶性肿瘤之首，其中在男性两者均是居第一位，而在女性发病率为第二位（低于乳腺癌），但死亡率居第一位[1]。由于肺癌早期时症状少，甚至没有症状，临床治疗效果差，5年存活率低。因此，寻找新的诊断方法及新的治疗靶点，能让我们在早期诊断及靶向治疗方面看到新的方向。APPL1(Adaptor protein containing PH domain，PTB domain and leucine zipper motif 1)是近年来发现的一个衔接蛋白、调节蛋白，介导脂联素的信号转导。它不但参与了葡萄糖和脂类的代谢，而且参与了脂连素介导的肥胖相关肿瘤的发生发展，如肝细胞肝癌。同时，APPL1接受细胞外表皮生长因子和氧化应激的刺激，与Rab5a在内涵体上相互结合，将生长增殖信号转导至细胞核内，进而引起基因表达的变化。APPL1在脂联素信号转导方面、2型糖尿病、结肠癌、乳腺癌[2]、肝癌等方面的研究已成为最近国外研究的热门，但是关于其与肺癌的关系的研究甚少。为了明确APPL1在肺癌组织中的表达及其与EGFR表达的关系，我们对50例肺癌组织及50例癌旁组织进行免疫组化检测，现报告如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料 收集赣州市人民医院2012年3月-2014年10月手术切除、有病理依据的肺癌的标本50例，对照组为距肿瘤边缘5cm处癌旁正常组织。所有肺癌病例均为原发性肺癌，经彩超、CT、电子支气管镜等检查排除转移性肺癌，排除感染性病灶。其中男41例，女9例，平均年龄（59.64±9.44）岁(36-75岁)；病理分型：腺癌 25例，鳞状细胞癌21例，小细胞癌4例；TNM分期：I期16例、Ⅱ期20例、Ⅲ期12例、Ⅳ期2例；术前未经过放、化疗以及靶向治疗。临床分期标准参考2009 IASLC国际肺癌分期(第七版)[3]。所用标本均为手术切除的大标本，将距肿瘤边缘5cm处肺组织作为正常组织对照；两组分别经4%甲醛液固定，然后石蜡包埋，3um连续切片等待免疫组织化学实验。

1.2 方法 免疫组织化学检测：应用Envision免疫组化法，兔抗人APPL1多克隆抗体（ab128591）为美国Abcam公司产品，兔抗人EGFR多克隆抗体为福州迈新公司产品。用已证实的APPLl阳性片（胎儿心脏组织的免疫组化片）作为阳性对照；用PBS缓冲液来代替一抗，作为阴性对照。分别检测APPLI蛋白和EGFR蛋白在肺癌细胞以及癌旁正常组织细胞中的分布、定位以及表达强度。APPLl阳性染色为细胞胞浆中的棕黄色颗粒。综合考虑免疫组化的细胞阳性强度及细胞阳性率，采用半定量积分进行分级，积分=染色细胞阳性率x染色强度。每张染色切片中随机选取5个高倍镜视野(10×40)，取每个视野中计数200个细胞。判断标准： 染色细胞阳性率：＜5%、6%-20%、21%-50%、＞50%分别计0分、1分、2分、3分；染色强度：无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别计0分、1分、2分、3分；2 种计分相乘，0 分阴性（-），1-3 分弱阳性（+），4-6阳性（++），7-9强阳性（+++）。 EGFR 标记以细胞浆和细胞膜出现了棕黄色颗粒为阳性结果，肿瘤细胞比率＞10%为阳性。

1.3 统计学处理 所有数据均采用SPSS 18．0统计软件统计，肺癌组织中与癌旁正常组织中APPL1的表达阳性率比较采用卡方检验，P＜0．05认为差异有统计学意义。APPL1在肺癌的表达与患者的年龄、性别、肿瘤分期、组织学类型的分析，采用秩和检验，P＜0．05认为差异有统计学意义。APPL1和EGFR在肺癌组织中的表达之间相关性的分析，采用 Spearman 秩和相关分析，P＜0．05， 有统计学意义。

2 结果

2.1 APPL1在肺癌组织及癌旁正常组织中的表达情况 本实验中50例肺癌组织中有35例呈不同程度的阳性表达，表达阳性率为70%(35/50)。而癌旁正常组织中APPL1阳性表达率为16%(8/50)，表达明显低于肺癌组，肺癌组织与癌旁正常肺组织组之间阳性表达率差异比较具有统计学意义(P＜0．001)（见表 1）。

表1 肺癌组织与正常组织APPL1表达的比较

2.2 APPL1在肺癌组织中不同临床病理特征的表达情况 组织学类型：阳性率：腺癌64%（16/25）；鳞癌76.19%(16/21)；小细胞癌75%(3/4)。3组样本按不同的表达程度，采用秩和检验，P值＞0.05，差异无统计学意义。临床分期：分别统计不同组织类型肺癌各临床分期的APPL1的阳性表达，采用秩和检验，P值＞0.05，差异无统计学意义。性别：分别统计不同性别的肺癌组织中APPL1的阳性表达，采用秩和检验，P值＞0.05，差异无统计学意义。年龄：分别统计不同年龄（分＜60岁和＞=60岁两组）的肺癌组织中APPL1的阳性表达，采用秩和检验，可见P值＞0.05，差异无统计学意义。（见表2）

2.3 APPL1与EGFR在肺癌组织中的表达情况的比较 分别统计肺癌组织中EGFR与APPL1的阳性表达，采用Spearman秩和相关分析相关性，结果见表中可见P值＜0.05（在置信度 （双测）为0.05时，相关性是显著的），差异有统计学意义，说明APPL1与EGFR在肺癌中的阳性率存在一致性，两者在肺癌中的表达可能存在相关（见表3）。

3 讨论

APPLl是近年发现的一种介导脂联素信号转导的调节蛋白。APPLl由709个氨基酸组成，基因定位于染色体3p14.3-p21.1，包含有22个外显子和21个内含子，其全长45．6kb，包含氨基端的PH(Pleckstrin homology)结构域、BAR (Binamphiphysin-Rvs)结构域和羧基端的磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域[4]。脂联素水平的减少已经在多个疾病中观察到，诸如2型糖尿病，肥胖的各种临床疾病中观测，胰岛素抵抗[5，6]，心血管疾病[7]和高血压[8]。

APPL1由BAR、PH以及PTB三个多功能结构域组成[9]，通过不同的结构域选择性的与多膜受体、胞内信号分子相互作用，在细胞膜与细胞质之间进行着信号传递，参与细胞的生长、增殖和分化。

本研究结果表明APPL1在肺癌组织中的表达具有较高的阳性率，肺癌组织与癌旁正常肺组织组之间阳性表达率差异比较具有统计学意义(P＜0．001)，有望成为一种新的免疫标志物，或可应用于肺癌的临床免疫组化诊断和鉴别诊断，或者成为一个新的治疗靶点。本实验研究了肺癌患者年龄、性别、组织学类型及临床分期等临床病理特点与APPL1的关系。结果表明APPL1与患者年龄、性别、临床分期、无显著相关性(P＞0．05)，而 APPL1 与EGFR在肺癌中的表达有相关性（P＜0.05）。

表2 APPL1在肺癌组织中不同临床病理特征的表达比较

表3 肺癌APPL1与EGFR测定结果的比较

表皮生长因子受体(EGFR)家族被证实与许多肿瘤的发生、发展有着密切的关系，广泛分布在人体各组织细胞膜上的一种多功能糖蛋白，是酪氨酸激酶信号通路上的一个重要分子。肺癌中EGFR有着较高的分布及表达已经得到了大量资料充分证实，之前就有研究显示，45-85%非小细胞肺癌患者中存在EGFR的过度表达或者异常激活[10]。APPL1是EGF信号转导途径的下游效应因子，研究证实，在EGF的刺激下，APPL1调节EGFR的蛋白水平，APPL1的表达与EGFR的蛋白水平呈正相关[11]。Miaczynska M等实验证实，APPL1和APPL2是Rab5的两个新的效应体，接收EGF的信号，APPL1与Rab5的相互作用来调节细胞的增殖，APPL1与Rab在内吞运输中的信号转导中的作用具有至关重要的意义[12]。本实验证实APPL1在肺癌组织中高表达，且同时与EGFR在肺癌组织中的表达相关，这或许能成为肺癌诊断及治疗的新的切入点，提供新的思路。