马属动物传染性贫血流行病学调查

刘晓燕

（云南省楚雄州动物疫病预防控制中心 675000）

1 概述

马传染性贫血简称马传贫 (Equine Infectious Anemia，EIA)，又称沼泽热，是由马传染性贫血病毒引起的马属动物的一种传染病，我国列为二类动物疫病，世界卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病[1]。其临诊症状是发热、贫血、出血、黄疸、心脏衰弱、浮肿和消瘦等，并反复发作，发热期（有热期）临诊症状明显，间歇期（无热期）则临诊症状逐渐减轻或暂时消失；病毒可引起持续性感染和免疫病理反应。本病只感染马属动物，病马和带毒马是主要的传染源，其血液和发生病变脏器内含有大量病毒，随分泌物和排泄物排出体外而散播，也可经被病毒污染的注射器和诊疗器械散播。马属动物中以马最易感，驴、骡次之。任何年龄、任何品种的马属动物均可感染发病，以吸血昆虫活动频繁的夏季多发，主要通过虻、蚊、刺蝇及蠓等吸血昆虫的叮咬而传染。潜伏期长短不一，人工感染平均为10～30d，短的为5d，长的可达90d以上[2]。该病于1843年首次在法国发生，后随两次世界大战而传播到世界各地。1931年日本侵华时把此病带入我国东北及华北等地，1954年和1958年由苏联进口马匹时又将该病传入我国，1966年后已蔓延到全国17个省市。为了防制马传贫，中央农林部（现在的农业部）于1972年在黑龙江召开了《马传染性贫血病防制工作座谈会》，并以农林部 〔72〕农林（牧）字第38号印发了《马传染性贫血病的防制试行规定》，根据试行规定和云南省农业厅的布置，楚雄州于1978年制定了马传贫防治规划，并于当年召开会议研究部署，举办化验人员培训班，并开展了大面积采样检测普查工作，并于1993年11月获得马传贫防制工作经考核验收达到稳定控制标准。

为实现2016年底，全州达到并通过 “消灭马传贫达标”验收标准这一目标，本研究从2014年连续3年组织开展了马属动物养殖情况调查和马传贫病流行病学调查等工作，为楚雄州消灭马传染性贫血提供参考依据。

2 材料与方法

2.1 样品来源

本实验所用样品均来自楚雄州十县（市），2014年送检样品2576份；2015年送检样品3106份；2016年送检样品3123份；3年共计8805份。

2.2 实验试剂

哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司提供的马传染性贫血琼脂扩散实验抗原及马传染性贫血琼脂扩散实验阳性血清。

2.3 实验设备

微波炉（合肥三洋荣事达电器有限公司，型号：EM-500S）、双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂，型号：SZ-93）、恒温水浴锅等，以上仪器均由楚雄州动物疫病预防控制中心兽医实验室提供。

2.4 实验方法马传染性贫血琼脂凝胶免疫扩散实验法

2.4.1 范围

本标准规定了马传染性贫血的琼脂凝胶免疫扩散技术要求。

本标准适用于马传染性贫血的诊断和检疫。

2.4.2 胶免疫扩散实验

2.4.2.1 材料准备

抗原：检测用抗原按说明书使用。

血清：（1）检验用标准阳性血清：能与合格抗原在12h内产生明显致密沉淀线的马传贫血清，做8倍以上的稀释仍保持阳性反应者为宜。小量分装，冻结保存。（2）被检血清：不含防腐剂和抗凝剂的被检马血清。

2.4.2.2 操作方法

（1）制备琼脂板

取优质琼脂1.0g，直接放入含有万分之一硫柳汞的100ml的PBS中，用热水浴溶化混匀。

将直径90mm的平皿放在上平台上，每平皿倒入热溶化琼脂液20ml，厚度约2.5mm左右，注意不要产生气泡，冷凝后加盖，把平皿倒置，防止水分蒸发，放在普通冰箱中可保存两周左右。

根据受检血清样品多少亦可采用大、中、小3种不同规格的玻璃板。10cm×16cm的玻璃板加注热琼脂液40ml；6cm×7cm的加注11ml；3.2cm×7.6cm的加注6m。（配成的琼脂液，可装瓶中用胶塞盖好，以防止水分蒸发，待使用时，现溶化现制板）。

（2）打孔

反应孔现用现打。在坐标纸上画好七孔型图案。把坐标纸放在带有琼脂板的平皿或玻璃板下面，照图案在固定位置上用金属管打孔，将切下的琼脂片取出，勿使琼脂膜与玻璃面离动。抗原孔及外周孔孔径均为5mm，孔间距3mm（见附图）。

附图 七孔型

（3）滴加抗原和血清

在琼脂板上端写上日期及编号。在图1七孔型的中央孔加抗原，外周2、4、6孔加检验用标准阳性血清，其余1、3、5孔分别加入被检血清。加至孔慢为止，平皿加盖。待孔中液体吸干后，将平皿倒置，以防水分蒸发；琼脂板则放入湿盒中。置15～30℃条件下进行反应，逐日观察3d并记录结果。

2.4.2.3 结果判定

（1）阳性

当检验用标准阳性血清孔与抗原孔之间只有一条明显致密的沉淀线时，受检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线；或者阳性血清的沉淀线末端在毗邻的被检血清孔向抗原孔侧偏弯者，此种受检血清判定为阳性。

（2）阴性

被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或向受检血清孔侧偏弯者，此种受检血清判定为阴性。

（3）疑似

标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端，似乎向毗邻受检血清孔内侧偏弯，但不易判断时应重检，仍为可疑，判为阳性。

在观察结果时最好从不同折光角度仔细观察平皿上抗原孔与受检血清孔之间有无沉淀线。为了观察方便，可在与平皿有适当距离的下方，置一黑色纸等，有助于观察。

3 结果

3.1 马属动物养殖及流行病学调查情况

为摸清楚雄州马属动物实际存栏数，为消灭净化马传贫采样提供依据，2014～2016年，全州每年组织开展一次马属动物入户普查及流行病学调查工作，及时建立更新和完善马属动物养殖档案（到户花名册），其调查情况详见附表。

3.2 马传贫监测工作开展情况

在马属动物入户普查及流行病学调查的基础上，从2014～2016年连续3年每年按存栏2%以上比例随机不重复采样要求，在楚雄州10县（市）103个乡镇中采集马属动物血清，用琼扩实验方法进行马传贫监测，3年累计在10个县（市）、229个乡（镇）、508个村委会、6555户养殖户中监测马属动物8805匹，占存栏2.54%，结果全部阴性。

4 讨论

4.1 检测方法

本研究所使用检测马传染性贫血病的检测方法是在国际贸易中的指定方法，琼脂凝胶免疫扩散实验 (AGID)[3]。该方法最早于1965年由解放军兽医大学首次分离马传贫病毒成功，进而成功研制了马传贫补体结合反应和琼脂扩散反应两种特异诊断法[4]。1975年哈尔滨兽医研究所又研制成功了马传贫驴白细胞弱毒疫苗。本次实验主要检测马传贫的技术为哈尔滨兽医研究所研制的马传染性贫血病（简称马传贫病）诊断试剂，是用我国培育的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株制作的抗原，具有特异、敏感、产量高和成本低等特点，并且能准确有效检测出马传贫病强阳性、弱阳性和健康马[5]。

4.2 范围及结果

楚雄州马传贫普查和检疫净化工作从1978年至1992年，历时15年开展了12次普查，覆盖面达全州11县（市）（包括禄劝县在内）、163个乡（镇）、1487个村公所办事处、16216个生产合作社，全州参加普查的畜牧兽医科技人员达2006人次。采集马属动物血清用琼扩实验检测130469匹，检出阳性畜202匹，对检出的202匹阳性畜全部进行扑杀及无害化处理。2014年至2016年，本研究按存栏2%以上比例随机不重复采样要求，在全州10县（市）103个乡镇中采集马属动物血清，用琼扩实验方法进行马传贫监测，3年累计在10个县（市）、229个乡（镇）、508个村委会、6555户养殖户中监测马属动物8805匹，占存栏2.54%，结果全部阴性。

5 结论

本研究从2014年连续3年组织开展马属动物养殖情况调查和马传贫病流行病学调查等工作，结果显示，2014～2016年间未发现有临床表现的病畜，提示从1985年开始开展畜禽及其产品检疫起至今，楚雄州未发生过马传染性贫血病临床病例；实验室检测结果显示，2014～2016年间未检测出阳性样品，提示从1990年至今，楚雄州未检出马传染性贫血阳性动物。研究结果为楚雄州消灭马传染性贫血提供了重要的理论参考依据。

附表 2014～2016年马属动物存栏情况表