牛奶制品与植物蛋白制品中主要蛋白质组成的比较分析

俞海东，韩荣勋，罗静波

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州434025)

植物蛋白制品一般是由大豆蛋白或乳清蛋白等几种蛋白混合而成的高纯度蛋白质粉剂，而牛奶制品是收集正常饲养的健康奶牛乳房分泌的原乳后再经过一系列加工后得到的一种富含蛋白质的产品。蛋白质约占人体重量的17%～20%，是组成人体细胞组织的重要成分，也是生命活动的主要执行者。牛奶蛋白质的生物价为85，而小麦、大豆、玉米和小米蛋白质的生物价分别为67、64、60和57[1]。因此生物价较高的牛奶可以作为烧伤、感染、做过外科大手术、神经性厌食、消化不良、小肠吸收障碍等患者以及孕妇、乳母、进食少的老年人和专业健身人群及运动员的优良蛋白质来源[2]。随着近年来生活水平的提高，人们对高蛋白食物的需求也越来越高，植物蛋白制品和牛奶制品越来越得到人们的青睐，其市场也日益火爆。然而为了降低成本，生产者往往会加入大豆蛋白等异源蛋白，这会影响牛奶蛋白质的组成比例和人体对牛奶蛋白质的消化吸收[3]。到目前为止已有许多关于牛奶或牛奶制品中掺入三聚氰胺、尿素或植物蛋白等物质的相关报道。这些研究主要采用HPCE[4]、LC-MS/MS[5]、分子印迹聚合物法[6]、荧光光谱法[7]、酶联免疫检测方法[8]、GC-MS/MS[9]等技术来检测是否混有三聚氰胺，或采用同位素稀释质谱法、HPLC和分级消解法[10]等方法检测是否混有尿素。关于牛奶制品中是否加入植物蛋白等的研究相对较少，主要涉及采用LC-MS及分子检测法进行定性检测[11]，而采用聚丙烯酰氨凝胶电泳法快速检测的相关报道比较少。

本研究采用聚丙烯酰氨凝胶电泳法分析植物蛋白制品、巴氏消毒牛奶、奶粉及酸奶的主要蛋白质组成，观察植物蛋白制品和不同牛奶制品中蛋白质组成的差异，从而为实验室检测牛奶制品中是否加入植物蛋白及衡量乳制品的产品品质提供参考依据，也为人们从植物蛋白制品和牛奶制品中选择更容易消化吸收的产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品的采集和准备

实验样品为从市场购买的植物蛋白制品、巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶。植物蛋白制品和牛奶奶粉均按照各自说明书分别配置成植物蛋白制品混悬液和奶粉溶液，巴氏消毒牛奶在4℃、12000r/min条件下离心20min除去乳脂和杂质。将100μL植物蛋白制品混悬液、奶粉溶液、巴氏消毒牛奶以及酸奶样品分别与等体积的裂解缓冲液(0.3% SDS、3% DTT、蛋白酶抑制剂和0.5mol/L Tris/HCl，pH8.0)充分混合后在低温条件下对样品进行超声波粉碎处理。在室温条件下反应1h后，在4℃、12000r/min条件下离心20min去除沉淀物。取上清液，以1mg/mL牛血清白蛋白溶液作为标准溶液，采用Bradford法测定蛋白浓度后分装成每管60μg样品并保存于-70℃冰箱中。

1.2 SDS-PAGE分析法

本研究中SDS-PAGE分别采用8%和15%的分离胶[1.5mol/L Tris(pH8.8)、40% Acry/Bis(29∶1)、蒸馏水、10% SDS、10% APS、TEMED]，并采用同等蛋白质含量的上样方法，上样顺序为Marker、60μg植物蛋白制品蛋白、60μg巴氏消毒牛奶蛋白，Marker、60μg植物蛋白制品蛋白、60μg奶粉蛋白，Marker、60μg植物蛋白制品蛋白、60μg酸奶蛋白。在100V电压条件下进行分离，实验所用Marker电泳后出现6条条带，相对分子质量分别为200、150、100、80、60、40ku。

电泳结束后取出凝胶，经超纯水漂洗后将凝胶放入固定液[30%(体积比)甲醇、10%(体积比)醋酸]中固定，1h后取出凝胶放入考马斯亮蓝R-250染色液中染色24h。染色结束后用脱色液(1%醋酸)脱色后进行图像采集。

2 结果与分析

对相同蛋白质质量的植物蛋白制品、巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶，在相同电泳条件下，采用8%、15%的分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，所得的电泳图谱见图1～图6。

将所得蛋白质电脉图谱进行比对分析可得出，在8%的分离胶中观察到植物蛋白制品蛋白在100～40ku区域内存在5条明显的蛋白质条带；而在巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶蛋白在40ku以下存在2条条带，分别为αs-酪蛋白条带以及还未分离的β-酪蛋白、κ-酪蛋白和乳球蛋白的混合条带。在15%的分离胶中观察到植物蛋白制品蛋白在80ku以下区域存在7条明显的蛋白质条带，而巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶蛋白在40ku以上不存在蛋白质条带；在40ku以下存在5条条带，分别为αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳球蛋白条带。总体来说，植物蛋白制品相对于牛奶含有更多的高分子量蛋白质，例如在100～40ku区域内存在4条条带；而牛奶中主要含有小分子量蛋白质，例如在小于30ku的区域内存在4条条带。

图1 用8%分离胶分离所得植物蛋白制品及巴氏消毒牛奶蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱 图2 用15%的分离胶分离所得植物蛋白制品及巴氏消毒牛奶蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱

图3 用8%分离胶分离所得植物蛋白制品及牛奶奶粉蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱 图4 用15%的分离胶分离所得植物蛋白制品及牛奶奶粉蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱

图5 用8%分离胶分离所得植物蛋白制品及酸奶蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱 图6 用15%的分离胶分离所得植物蛋白制品及酸奶蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱

3 讨论与结论

为了探讨植物蛋白制品和牛奶制品的蛋白质组成差异，本研究采用SDS-PAGE法比较分析了植物蛋白制品、巴氏消毒牛奶、奶粉和酸奶等奶制品的主要蛋白质组成。结果表明，植物蛋白制品与牛奶制品的蛋白质组成之间表现出显著差异。在8%分离胶凝胶电泳图谱中能观察到植物蛋白制品有5条蛋白质条带，而牛奶制品中的蛋白质条带只有2条；在15%分离胶凝胶电泳图谱中能观察到植物蛋白制品有7条蛋白质条带，而巴氏消毒牛奶和牛奶奶粉中只能在40ku以下区域内观察到5条蛋白质条带，酸奶只能观察到4条蛋白质条带。在15%分离胶中，相同的电压和分离时间下，酸奶相对于巴氏消毒牛奶和牛奶奶粉少了1条酪蛋白条带。这可能与酸奶经过乳酸菌发酵有关，在发酵过程中，乳酸菌将乳蛋白分解，所以在15%分离胶中只能观察到4条蛋白质条带。

本研究数据可为鉴别牛奶制品当中是否加入植物蛋白提供参考。已报道的有关鉴别奶粉中是否掺入植物蛋白的研究中，宋宏新等[11]采用SDS-PAGE法比较分析了脱脂乳中掺入一定比例的大豆蛋白粉和乳清蛋白粉，发现该方法的最低检出限分别为0.79%和4.4%(质量比)，并且得到了与本研究中巴氏消毒牛奶和牛奶奶粉结果类似的脱脂乳SDS-PAGE图谱，2个实验结果类似的原因可能是因为使用的都是牛奶和牛奶制品以及相似的方法，但是本研究所涉及的酸奶是经过乳酸菌发酵而成的牛奶制品，所以酸奶的图谱与他们的图谱有所差异。

本研究采用的是比较简便的SDS-PAGE法，并且未除去牛奶中的高丰度蛋白——酪蛋白，所以只能观察到牛奶中占主要成分的酪蛋白和乳球蛋白的条带，而无法观察到牛奶中低丰度蛋白——乳清蛋白的条带。这一结果可以应用到牛奶及与牛奶相关的奶制品中是否加入乳清蛋白的鉴定上。如果在蛋白质图谱中能明显地观察到酪蛋白和乳球蛋白条带以外的蛋白质条带的话，就可以怀疑是否加入如植物蛋白制品或乳清蛋白粉等其他蛋白质类物质。到目前为止，有关巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶等牛奶制品蛋白与植物蛋白制品蛋白比较的研究鲜有报道。本研究揭示了巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶等牛奶制品蛋白与植物蛋白制品蛋白在组成上的差异。本结果对于实验室检测牛奶制品中是否含有植物蛋白提供了参考依据，也可为消费者从各种奶制品和植物蛋白制品中选择更容易消化吸收的产品提供参考。