虎杖基因PcMYB1真核表达载体构建及遗传转化

李晓筱,刘婵,徐俊雄,王岩岩 伍翔,覃建兵,柳忠玉

(长江大学生命科学学院,湖北荆州 434025)

虎杖是蓼科多年生药用草本植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.)的干燥根茎，药用历史悠久，药用成分主要包含蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类、鞣质及多糖等化合物[1]。经研究，虎杖具有抗炎抗菌、保护心血管系统、调节血液系统、抗肿瘤等多种功能[2]。虎杖药效成分中的白藜芦醇、类黄酮等物质都经由苯丙烷类代谢途径而来[3,4]。

笔者所在课题组通过RT-PCR和RACE技术从虎杖中获得了1个MYB转录因子基因，命名为PcMYB1，GenBank登录号为KY495789。经生物信息学分析，PcMYB1基因的开放读码框长为813bp，编码270个氨基酸残基，具有典型的R2R3-MYB转录因子的二级结构和三级结构。系统进化树分析表明，PcMYB1与Sg4亚家族的R2R3-MYB转录因子有较近的亲缘关系，PcMYB1蛋白的C端区域具有4个典型的Sg4亚家族的保守序列，分析预测PcMYB1可能是1个在苯丙烷类代谢中起负调控作用的R2R3-MYB转录因子。

近年来研究人员已对多种植物的R2R3-MYB转录因子进行了研究并取得了较大的进展[5～10]，但在虎杖中对该类转录因子基因的研究还很少，该研究拟通过构建PcMYB1的植物过表达载体，转化拟南芥以进一步探究虎杖R2R3-MYB转录因子PcMYB1基因的功能。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料为拟南芥(Columbia 生态型)；含有目的基因PcMYB1的1K-5质粒、含35S启动子的P5002质粒、大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株EHA105、植物表达载体pCAMBIA 1380均由长江大学生命科学学院分子生物学实验室保存。

TaqDNA聚合酶，限制性内切酶Hind Ⅲ、PstⅠ、BamHⅠ，T4连接酶，卡那霉素(Kanamycin,Kan)，潮霉素(hygromycin,hyg)、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购于宝生物大连有限公司，所用引物和测序服务均由武汉生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1PcMYB1基因植物表达载体构建

以含有35S启动子的P5002质粒为模板，以含有目的基因PcMYB1的1K-5质粒为模板，设计特异引物经PCR分别扩增虎杖PcMYB1的基因片段与35S启动子片段，回收纯化后分别将其克隆至pUC19的BamHⅠ/PstⅠ位点与PstⅠ/HindⅢ位点，得到重组载体pUC19-35S-PcMYB1，其间构建的中间载体为pUC19-35S。对重组载体pUC19-35S-PcMYB1进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切，获得包含35S启动子和PcMYB1基因的酶切片段，回收纯化后将该片段克隆至植物表达载体pCAMBIA 1380的BamHⅠ/HindⅢ位点，获得植物过表达载体pCAMBIA 1380-35S-PcMYB1。构建过程如图1所示。

图1 PcMYB1A1380-35S-PcMYB1表达载体构建示意图

该载体构建过程中，PCR扩增所需的基因特异引物序列见表1。常规PCR扩增产物均用1%琼脂糖凝胶电泳后进行试剂盒回收；酶切反应条件为37℃，1.5h；连接反应体系20μL，在T4连接酶的作用下进行连接，条件为22℃ 1h、65℃ 10min。将连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经相应抗生素筛选获得阳性单克隆菌落，抽取质粒经PCR和双酶切初步鉴定后送至测序。

表1 基因特异引物序列

1.2.2PcMYB1基因的拟南芥转化

正确构建的PcMYB1基因过表达载体pCAMBIA 1380-35S-PcMYB1通过电击转化法进入根癌农杆菌EHA105中，经筛选挑取阳性克隆后进行PCR及酶切验证。以携带重组质粒pCAMBIA 1380-35S-PcMYB1的农杆菌菌液为工作液，以花絮浸染法[11]转化即将开花的拟南芥野生植株。

1.2.3拟南芥转化子的筛选与鉴定

T0代拟南芥种子经消毒后点在含潮霉素(浓度为25mg/L)的MS培养基上进行筛选，挑选在培养基上正常生根成长的两周拟南芥幼苗进行移栽，抽提6周龄大小的拟南芥植株的基因组DNA，设计潮霉素基因特异引物进行PCR鉴定。

2 结果与分析

2.1 PcMYB1基因的植物过量表达载体构建

35S启动子大小为536bp，PcMYB1开放阅读框(ORF)序列长813bp，总的插入片段大小为1349bp。用限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ酶切的重组质粒pUC19-35S(图2a)；用限制性内切酶PstⅠ和HindⅢ酶切的重组质粒pUC1935S-PcMYB1(图2b)；用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切质粒pCAMBIA1380-35S-PcMYB1(图2c)，酶切结果均与预期相同，初步证明载体构建成功。经过测序验证序列正确，即成功构建了带有35S启动子和PcMYB1基因的植物过量表达载体pCAMBIA1380-35S-PcMYB1。

1.BamHⅠ和PstⅠ酶切的pUC19-35S;2.PstⅠ/HindⅢ酶切的pUC1935S-PcMYB1; 3.BamHⅠ/HindⅢ酶切的pCAMBIA1380-35S-PcMYB1；M:DNA分子量标准DL2000 Marker图2 重组质粒酶切鉴定

2.2 拟南芥遗传转化

图3 拟南芥各个时期的生长情况

图4 潮霉素抗性筛选拟南芥株系

采用农杆菌介导的方法，以携带重组质粒pCAMBIA1380-35S-PcMYB1的农杆菌菌液为工作液，用花絮浸染法转化即将开花的拟南芥植株(大约6～7周龄)，拟南芥各个时期的生长记录如图3所示。

2.3 转基因拟南芥的潮霉素筛选与PCR鉴定

收集T0代种子(约8700粒)，在含有25mg/L潮霉素的MS固体培养基平板上筛选，得到10株抗性幼苗，初步得出拟南芥阳性转化率为0.11%。在潮霉素抗性培养基上生长约2周的拟南芥幼苗，抗性株系能够正常生长出真叶，幼苗叶片呈正常绿色，并正常生根。而非抗性株系长到两片叶子便停止生长，不能生长出真叶，并且幼苗在生长的过程中叶片逐渐变黄变白，且不能正常生根，最后直至死亡(图4)。

2.4 转基因植株的PCR鉴定

将具有潮霉素抗性的拟南芥2周龄幼苗移栽至盆土中，生长约4周后提取拟南芥叶片基因组DNA，设计潮霉素基因特异引物进行PCR鉴定。以植物过表达载体pCAMBIA1380-35S-PcMYB1质粒作为阳性对照，所检测的拟南芥抗性株系都能扩增出大小约500bp的条带，而阴性对照的拟南芥野生型株系未能扩增出任何条带(图5)。潮霉素基因PCR扩增结果初步证明PcMYB1基因已经整合入拟南芥植株的基因组中。

3 讨论

研究发现，C2基序pdLNL[D/E]LXI[G/S]为典型的抑制结构域，具有转录抑制活性[3]。含有C2基序的MYB转录因子通常在苯丙烷类代谢途径中起负调控作用，大部分调控类黄酮合成的MYB转录因子都是R2R3-MYB转录因子[12]，如，荷花中R2R3-MYB转录因子NnMYB4的C端具有C2基序pdLNL[D/E]LXI[G/S]，在拟南芥中表达后，木质素含量明显降低[13]；银杏中负调控蛋白GbMYBF2抑制花青素及黄酮类物质的的生成[7]；EgMYB1[8,9]、ZmMYB31[14]等在生物合成中对木质素的合成起抑制作用。目前，对虎杖苯丙烷类代谢中MYB转录因子的功能知之甚少，该研究构建了PcMYB1基因的植物过量表达载体，利用花絮浸染法成功将其转入模式植物拟南芥中，为拟南芥转化纯合株系的筛选以及功能验证的研究奠定了基础。在拟南芥转化研究方面，利用花絮浸染法侵染拟南芥来获得阳性植物株系并不十分高效，研究初步得出拟南芥阳性转化率为0.11%，本研究所建立喷雾法转化拟南芥的体系也在摸索当中，希望借此建立一种更高效的基因转化方法。