老鸦瓣多糖的制备及其对H2O2致果蝇氧化损伤的保护作用

周妍，肖兵，张明冬，韦慈，孙玉军

(安徽科技学院生命与健康科学学院，安徽 凤阳233100)

植物多糖作为一种天然高分子聚合物，具有抗氧化、延缓衰老、降血糖、降血脂，提高机体免疫力、抗肿瘤等功效[1]，近年来已成为生物与医药领域研究的热点。

老鸦瓣(Tulipaedulis)为百合科多年生草本植物，是中药“山慈菇”的传统正品品种，盛产于安徽、河南、江苏、山东等地[2]。老鸦瓣早春发芽并开花，因此民间称之为“迎春草”，其地下鳞茎为椭圆形，具有清热解毒、消肿以及抗肿瘤等作用[3]。目前，国内外学者对老鸦瓣黄酮、多糖等功能成分的研究报道较少。笔者以老鸦瓣地上部分为材料提取制备老鸦瓣多糖(polysaccharide fromTulipaedulis, PTE)，利用H2O2致果蝇氧化损伤，并采用不同浓度的老鸦瓣多糖饲喂，测定果蝇体内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量等抗氧化指标，以研究老鸦瓣多糖的抗氧化能力，为老鸦瓣多糖的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

老鸦瓣由安徽省蒙城县南望槐种植专业合作社馈赠。黑腹果蝇由安徽科技学院生命与健康科学学院遗传学实验室提供。SOD活力测定试剂盒、丙二醛含量测定试剂盒、CAT活力测定试剂盒、蛋白含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；蔗糖、KH2PO4、丙酸、H2O2等均为国产分析纯。

主要仪器设备有：FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)、L550离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)、U-T6PC紫外可见分光光度计(屹谱仪器制造上海有限公司)、Multiskan Go全波长酶标仪(美国Thermo Scientific公司)、R1001-VN旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)、51-0800果蝇培养管(美国BIOLGIX公司)和SW-CJ-1F单人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 老鸦瓣多糖的制备

称取一定量的老鸦瓣粉末，按料液比1∶25加入蒸馏水，于70℃温水中浸提3h，4800r/min离心15min，取上清液，旋转蒸发浓缩至适当体积后，加入3倍体积的95%乙醇，沉淀，静置过夜，4800r/min离心15min，去除上清液，沉淀依次经乙醚、丙酮洗涤，取适量蒸馏水溶解，采用Sevag法[4](氯仿：正丁醇=4∶1)脱蛋白，活性炭脱色，冷冻干燥得老鸦瓣多糖。

1.2.2 老鸦瓣多糖的红外光谱测定

称取老鸦瓣多糖PTE 2mg和KBr粉末100mg于玛瑙研钵中研磨混匀，压片，采用红外光谱仪于400～4000cm-1区间扫描。

1.2.3 老鸦瓣多糖的理化性质测定

双缩脲反应参照文献[5]；Molish反应参照文献[6]；CTAB反应参照文献[7]；斐林试剂反应参照文献[8]；总糖含量的测定参照文献[9]。

1.2.4 果蝇的分组培养

挑选健康2日龄的果蝇随机分组，每组3管，每管30只，设空白对照组、模型对照组(除在培养基中添加10% H2O2)、阳性对照组(在培养基中添加10% H2O2和0.3mg/mL Vc)和5个多糖试验组(除在培养基中添加10% H2O2外，另分别添加 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL多糖)。

果蝇培养基基本成分：自来水100mL、玉米粉10.5g、蔗糖7.5g、琼脂粉0.75g、丙酸0.625mL和酵母粉2g。

1.2.5 果蝇体内抗氧化指标的测定

试验进行7d后，将果蝇用乙醚麻醉处死后，准确称重，按重量(g)∶生理盐水(mL)=1∶9的比例，在冰浴条件用玻璃匀浆器制成组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清液。按试剂盒说明书分别进行蛋白质含量、SOD活力、CAT活力以及MDA含量的测定。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 18.0软件处理分析，以Mean±SD表示，P<0.05表示差异显著，以a表示，P<0.01表示差异极显著，以b表示。

2 结果与分析

2.1 老鸦瓣多糖红外光谱结果分析

图1 老鸦瓣多糖的红外光谱图

老鸦瓣多糖的红外光谱如图1所示，其主要吸收峰及其归属情况如表1所示(表中2922 cm-1是糖类物质的典型特征吸收峰[9])，由表1可知，PTE是一种具有α-D-葡萄吡喃糖苷键的多糖。

表1 老鸦瓣多糖红外光谱吸收峰归属

2.2 老鸦瓣多糖的理化性质

表2 老鸦瓣多糖的一般理化性质

老鸦瓣多糖PTE的一般理化性质如表2所示。以葡聚糖DextranT10为标准，根据葡聚糖标准曲线，得出多糖含量测定的回归方程为y=0.013x-0.004，R2=0.9993(式中：y为光密度值；x为多糖浓度值(mg/mL))。经计算，PTE中多糖含量为62.33 %。

2.3 老鸦瓣多糖对果蝇CAT活力的影响

表3 老鸦瓣多糖对果蝇体内CAT活力的影响

注：与模型组比较,a表示P<0.05；b表示P<0.01。

表4、表5同。

H2O2本身是一种非常不稳定的活性氧，可与细胞内的Fe2+通过Fenton反应生成具有高度活性的羟基自由基[10]，造成细胞内DNA、蛋白质和脂类的损伤，最终导致细胞死亡[11]。机体内的过氧化氢酶(CAT)能够催化H2O2分解氧和水，清除体内的H2O2，从而使细胞免遭H2O2的毒害。老鸦瓣多糖对果蝇体内CAT活力的影响如表3所示。由表3可知，随着老鸦瓣多糖浓度的增加，果蝇体内CAT活性逐渐增强。0.2mg/mL多糖组及0.3mg/mL多糖组果蝇体内CAT活性与模型组相比均显著升高(P<0.05)； 0.4mg/mL多糖组和0.5mg/mL 多糖组果蝇体内CAT活性与模型组相比极显著升高(P<0.01)。Vc组与模型组相比，果蝇体内CAT活性显著升高(P<0.05)。

2.4 老鸦瓣多糖对果蝇SOD活力的影响

表4 老鸦瓣多糖对果蝇体内SOD活力的影响

表5 老鸦瓣多糖对果蝇MDA含量的影响

超氧阴离子自由基(O2-·)是机体在代谢过程中产生的一种重要的活性氧，若得不到及时清除，也会对机体造成伤害。超氧化物歧化酶(SOD)是机体内清除超氧阴离子自由基的一种重要酶类[12]。SOD活力的高低能够反映出机体对超氧阴离子自由基的清除能力。老鸦瓣多糖对果蝇体内SOD活力的影响如表4所示。由表4可知，随着多糖浓度增加，果蝇体内SOD活性逐渐增强，且与模型组相比均极显著升高；Vc组与模型组相比，果蝇体内CAT活性显著升高(P<0.05)。

2.5 老鸦瓣多糖对果蝇MDA含量的影响

丙二醛(MDA)是由机体内的自由基引发脂质过氧化产生的，MDA含量高低常用作评价氧化衰老的一种指标[13]。SOD是机体内一种重要的抗氧化酶，能够有效清除超氧阴离子自由基(O2-·)，降低MDA及自由基代谢产物的含量，使细胞免遭破坏[12]。因此，机体内MDA含量的多少，与体内脂质过氧化的程度相关，可间接反映出细胞受损程度的高低。老鸦瓣多糖对果蝇体内MDA含量的影响如表5所示。由表5可知，随着多糖浓度的增加，果蝇体内MDA含量逐渐减少。0.4mg/mL多糖组和0.5mg/mL多糖组果蝇体内MDA含量与模型组相比较，均显著减少(P<0.05)。

3 小结

H2O2在机体内易转变成羟基自由基，氧化损伤细胞内的DNA、蛋白质等。由于H2O2极易获得，而且性质相对稳定，因而H2O2常作为体外氧化应激损伤模型的工具，模拟体内氧化损伤的病理过程。果蝇是双翅目果蝇属昆虫，其许多代谢途径、生理学功能和发育阶段同哺乳动物相似，具有与人类相似的发育过程、繁殖和衰老阶段。此外，果蝇是一种真核多细胞生物，具有寿命短、生长迅速、繁殖力强、高度纯种、饲养简便等优点[14]。因此，本研究采用H2O2来氧化损伤果蝇，探讨老鸦瓣多糖对果蝇氧化损伤的保护作用，结果显示，老鸦瓣多糖对H2O2氧化损伤的果蝇体内SOD、CAT活性及MDA含量产生影响，其中SOD、CAT活力显著或极显著升高，MDA含量显著降低，表明老鸦瓣多糖对H2O2致果蝇氧化损伤具有一定的保护作用。因此，老鸦瓣多糖作为一种天然的抗氧化药物，值得进一步研究，以利于今后加以开发与利用。