Hedgehog信号通路在人牙周膜干细胞应力成骨中的作用及转导机制

张洁

（杭州市儿童医院，浙江 杭州 310014）

矫治性牙位移动过程中，牙槽骨的应力改建主要是以破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成相互协调的结果。其中张应力区中所发生的由成骨细胞介导的骨形成是错位牙矫治性定向移动中安全和稳定的根本保证。因此，研究牙槽骨应力条件下的分子机制对刺激应力成骨的骨形成选择高效的外源性途径，具有重要的临床意义。

人牙周膜干细胞 （Human periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是正畸牙移动过程中骨改建的关键细胞。Hedgehog（刺猬基因，Hh）信号通路在骨发育和成骨分化中具有重要作用[1]。而近年来研究提示，Hedgehog信号通路促进了PDLSCs的增殖过程[2]。前期研究发现，Hedgehog信号通路参与了PDLSCs应力成骨过程[3]。本实验利用FX-4000T细胞加力装置，模拟PDLSCs应力成骨的体外环境，通过分子生物学方法探讨Hedgehog信号通路在PDLSCs应力成骨过程中的作用及分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞培养基α-MEM （Alpha minimal essential medium，α-最低必须培养基）及优等胎牛血清、293FT细胞株均购自Invitrogen公司；慢病毒载体pGreenPuro购自Systembio公司；限制性内切酶、PCR试剂盒购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自Omega公司；SMO（Smoothened，原癌基因，sc-6366）、Gli-1（Glioma associated oncogene family zine finger，神经胶质瘤相关致癌基因家族锌指，sc-20687）、Patch1（Ptched，肿瘤抑制物，sc-9672）、Runx 2（Runt-related transcription factor 2， 核心结合因子，sc-101145）、ALP （Alkaline phosphatase，碱性磷酸酶，sc-79839）抗体均购自Santa cruz。采用FX-4000T应力加载系统（Flexcell International Corporation，美国）。

1.2 方法

1.2.1 PDLSCs的分离培养与鉴定 取12-15岁因正畸需要或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿，用1%双抗PBS反复冲洗，冠根单向刮取牙根中1／3的牙周膜，采用酶消化组织块法联合培养，48小时后首次换液，之后每3天换液，细胞融合至80%时传代，采用间充质干细胞标记蛋白（Stromal cell antigen，STRO-1） 抗体通过流式细胞仪细胞分选的方法获得第三代PDLSCs。

1.2.2 SMO siRNA慢病毒表达载体的构建、筛选及鉴定 根据GenBank人SMO基因（NM-005631），按照RNA干扰序列确定干扰靶点。将合成的干扰序列退火后连入BamH I和EcoR I酶切后的载体pGreenPuro中，构建质粒通过DNA测序验证。将对照载体及干扰载体包装病毒，转染293A细胞，筛选后收集细胞，通过定量PCR检测SMO基因的表达。取第3代PDLSCs进行病毒转染，转染效率为80%。荧光显微镜观察转染组（pGP-SMO1）、对照组（Control）细胞绿色荧光蛋白表达情况。Western印迹法检测各组在感染48小时后蛋白水平的表达。

1.2.3 细胞加载 通过国际标准化水平的加力装置FX-4000T对PDLSCs进行应力加载实验。将第4-6代PDLSCs的三组细胞（慢病毒干扰组PDLSCs/SMO-RNAi、空慢病毒感染组 PDLSCs/vector、正常细胞对照组PDLSCs/wt）分别种于BioFlex培养板内，继续培养12小时后，加载动态张应力。设置加载的方式为最大型变量12%，最小型变量0的正弦波，频率 0.1Hz，加力时间为 0、6、12、24 小时。 加力结束后分别提取各组细胞的蛋白质做后续检测。

1.2.4 Western印迹法检测提取样品中ALP、Runx2、Gli-1、Patch1、SMO 蛋白的表达 BCA 法蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。各组分别取蛋白150g上样，经10%SDS-PAGE凝胶电泳后转入PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2小时。加入一抗，4℃冰箱过夜，TBST洗膜4次后加入二抗，室温下轻摇半小时。TBST洗膜4次后，ECL工作液显影。将同一电泳所获得的ALP、Runx2、SMO与内参GAPDH的条带灰度值相比，得到各组样本目的蛋白灰度比值。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计。计量数据采用（±s）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 PDLSCs的分离培养 采用酶消化组织块法联合培养，48小时后可见部分组织块周边有细胞爬出，细胞形态呈梭形或不规则形，有2-4个凸起。详见图1。

2.2 PDLSCs的鉴定 流式细胞仪分选出的STRO-1阳性细胞经培养可见其形态与PDLCs形态相似，体积略小，多为漩涡状排列。详见图2。

2.3 流式细胞术表型分析 单标STRO-1阳性率为83.3%，单标CD146阳性率为89.9%，STRO-1和CD146双标阳性率为87%，说明所得细胞表达间充质干细胞早期标志物[4]。

2.4 PDLSCs中SMO基因干扰 转染培养的PDLSCs 48小时后荧光显微镜观察可见有较高的转染效率以及较强的荧光表达（图3），证明干扰病毒能有效地转染PDLSCs。收集细胞提取总蛋白进行Western印迹法检测SMO蛋白表达量，以GAPDH为内参，显示慢病毒干扰载体能够在蛋白水平有效地下调目的基因的表达（图4），表达量降低80%（干扰组灰度值0.22±0.04，对照组灰度值1.15±0.13，P＜0.01）。 说明本实验成功构建了能够在PDLSCs中下调SMO基因表达的病毒。

2.5 PDLSCs应力成骨过程中各实验指标 Western印迹法测得各组 ALP、Runx2、Gli-1、Patch1、SMO 的结果及IOD值，详见图5-7、表1。其中PDLSCs/vector组与PDLSCs/wt组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 成骨及Hh相关标志物的IOD值

3 讨论

矫治性牙位移动过程中骨改建的生物学基础在于适宜的力学刺激调节细胞的新陈代谢和基因表达，从而调控骨组织的形成和改建[5]。加速骨改建的生物学进程，缩短矫治性牙位移动的时间，对临床治疗有重要的指导意义。研究证实，牙周膜干细胞是正畸牙移动过程中应力作用的靶细胞，力学刺激作用于该细胞，通过胞外基质传导至胞浆引起一系列细胞内的生物学变化，从而触发牙槽骨的应力改建，最终实现了牙齿的定向移动[6]。这种将机械信号的刺激转化为生物反应的过程是通过一定的信号通路传导产生的。前期研究发现：与力学及成骨分化有关的Hedgehog（Hh）信号通路参与了人牙周膜干细胞的应力成骨过程，但调控机制尚不明了。

Hh信号通路包含Ptch、SMO及通路下游GLI等多种蛋白。在没有Hh配体的作用下，Ptch与SMO结合，抑制了SMO的活性，转录因子Gli的活性也受到抑制，此时通路处于失活状态，而当存在Hh配体时，Hh编码的蛋白会与Ptch受体结合，从而解除对SMO的抑制作用，SMO将Hh信号向细胞质传递，激活转录因子Gli入核，并激活Hh靶基因的表达[7-8]。SMO作为Hedgehog信号通路中最重要的信息转换器，负责Hh的信号传导，激活SMO即可导致Hedgehog靶基因的活化，继而控制细胞基本活动进程和方向[9]。因此，调节该分子的表达情况，阐明Hedgehog信号通路在PDLSCs受应力刺激下的作用，对于研究分析PDLSCs应力成骨的分子机制具有重要意义。

本实验利用RNAi成功抑制了SMO的表达后，比较实验组和对照组相关蛋白的表达情况：Runx2和ALP的蛋白表达水平明显降低，表明抑制Hh信号通路可以降低应力成骨中PDLSCs的骨向分化及成骨，提示Hh信号通路在应力成骨过程中具有调控作用，从分子水平解释了“Hh信号通路在将胞外的张应力刺激转化为胞内生化信号的过程中可能扮演重要角色”的结论。同时，Runx 2和ALP的蛋白表达水平在加力早期（0～6小时）时明显降低，随着加力时间的延长（6～12小时）表达仍有升高趋势，说明Hedgehog信号通路在PDLSCs应力成骨过程中的调控作用主要体现在分化的早期，这与Cho等[10]的研究结果不谋而合。此外，两组PDLSCs的Runx 2和ALP表达量均在应力作用12小时升高明显，说明应力刺激12小时具有较强的促成骨分化作用，这对后续实验加力时间点的选择有一定的指导意义。

综上，通过RNAi来抑制Hedgehog信号通路中核心分子SMO，从分子水平调控和干预PDLSCs应力成骨的过程，深入研究Hedgehog信号通路在PDLSCs应力成骨过程中的作用及分子机制，为提高矫治性牙位移动过程中牙槽骨的成骨效率提供了新的思路和途径。